Способ получения очищенного белка а золотистого стафилококка
Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повышение выхода продукта биологической активности белка А и его чистоты. Из нормальных сывороточных иммуноглобулинов класса G готовят аффинный сорбент. Пропускают белоксодержащее сырье через колонку с сорбентом. Полученный раствор собирают фракциями и контролируют активность белка А. Выход активности белка А увеличивается на 23%. Полученный белок А более гомогенен и свободен от стафилококковых токсинов. 2 з. п. ф-лы.
Изобретение относится к получению бактериальных препаратов. Целью изобретения является повышение выхода, биологической активности белка А и частоты. Пример 1. Золотистый стафилококк А-676 культивируют в реакторе для выращивания бактерийных культур на пептонодрожжевой питательной среде. Продолжительность выращивания 12 ч при 38-40oC, перемешивание со скоростью 300-500 об/мин и продувание стерильного воздуха через питательную среду в количестве 30 м3/мин. Культуру прогревают по окончании выращивания непосредственно в реакторе при 80oC 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и освобождают от микробной массы центрофугированием при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочный слой контролируют на активность белка А в реакции непрямой гамагглютинации с эритроцитами IgG человека. Для выведения белка А используют надосадочную жидкость (сырье) с титром не ниже чем 1:2560 в РНГА. До использования в операциях очистки сырье хранят при -20oC. Приготовление аффинного сорбента. Выделение IgG из сыворотки свиней. Свиную сыворотку, полученную на мясном комбинате в день убоя животны, в тот же день используют для выделения IgG. К 500 мл сыворотки добавляют 500мл дистиллированной воды и при постоянном перемешивании 666 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4. Через 18-20 ч выстаивания при комнатной температуре смесь центафугируют, надосадок удаляют, осадок растворяют в 150 мл 0,15 М раствора хлорида натрия и диализуют в течение 48 ч против 5 смен 0,02 М фосфатного буферного раствора, pH 7,0
0,1 (по 5 литров на каждую смену). Получают свободный от сернокислого аммония раствор суммарной глобулиновой фракции в объеме 200-250 мл. Этот раствор со скоростью 500 мл/ч пропускают через колонку с молселектом ДЕАЕ А-50 (диаметром 5 см при высоте слоя геля 95 см), предварительно уравновешенную 0,02 М фосфатным буферным раствором (pH 7,00,1). Этот же буфер пропускают через колонку после вхождения раствора белка в гель, фракцию белка, элюирующуюся в данном буфере, собирают. Получают 3-3,5 г IgG в объеме 800-1100 мл буфера. Приготовление иммуносорбента для очистки IgG от антител к стафилококовым антигенам. 2 л А белоксодержащего сырья пропускают через колонку с аффинным сорбентом, при этом получают 2 л жидкости, свободной от белка А, но содержащей прочие экстрацеллюлярные белки стафилококка. Жидкость концентрируют на ячейке ФМ-02 с фильтром "Рипор-4" до объема 50 мл, диализуют против 2 л 0,1 М раствора фосфата натрия двузамещенного и полученный концентрат бельков иммобилизуют на 50 мл геля CNBr-активированной агарогзы,используя все рабочие растворы в полном объеме. Готовый иммуносорбент упаковывают в хроматографическую колонку диаметром 3 см и высотой 10 см. Приготовление иммобилизованного овомукоида. 1 г коммерческого овомукоида растворяют в 50 мл 0,1 М раствора Na 2HPO4 и иммобилизируют не 50 мл CNBr-активированной агарозы. Готовый сорбент упаковывают в колонку диаметром 3 см и высотой 10 см. Очистка IgG свиньи на иммуносорбенте и иммобилизированном ингибиторе протеаз. Раствор IgG свиньи со скоростью 100 мл/ч при 4oC пропускают последовательно через колонки с иммобилизованными экстрацеллюлярными белками стафилококка и иммобилизированным овомукоидом, предварительно уравновешивая колонки 0,1 М фосфатным буферным раствором (pH 7,20,2)на 0,15 М растворе хлорида натрия (ЗФР). Затем полученный раствор IgG концентрируют до объема 100 мл на ячейке ФМ-02 с фильтром "Рипор-3". Иммобилизация IgG свиньи на CNBr-активированной агарозе. 30 г коммерческой CNBr-активированной агарозы (производства Института химиии НА ЭССР) промывают на фильтре Шотта 5 л воды, затем гель переносят в пластмассовый сосуд емкостью 0,5 л и добавляют к нему 50 мл 0,1 М двузамещенного фосфата натрия и 100 мл раствора очищенного IgG свиньи, компоненты быстро перемешивают и инкубируют при прямом перемешивании 2 ч при 18-22oC и 16 ч при 4oC. После этого гель переносят на фильтр Шотта, промывают 2 л 0,1 М двузамещенного фосфата натрия и 2 ч инкубируют с 200 мл 0,5 М раствора глицина. Затем гель промывают 2 л ЗФР, 2 л 1 М раствора хлорида натрия, 2 л 0,1 М глицинового буферного раствора (pH 3,0). Указанный цикл промывок повторяют еще 2 раза и гель переносят в колонку диаметром 4 см и промывают 5 л ЗФР на свободном потоке. Затем колонку промывают 1 л ЗФР с метриолатом в конечной концентрации 1:10000 и хранят с этим раствором до использования при 4oC. Очистка белка А. А-белкосодержащее сырье, имеющееся титр белка А 1:5120 в РНГА, осветляют на асбестовой пластине типа "Ф" и при 4oC пропускают через колонку с аффильным сорбентом, приготовленным из IgG свиньи, очищенным иимуносорбцией от антител к белкам стафилококка и от протеаза. Скорость процесса поддерживают на уровне 1500 мл/ч. Вытекающий раствор собирают фракциями по 1 л и контролируют в РНГП на активность белка А. Выход фракции вытекающего раствора с титром белка А 1:320 (1/6 исходного титра) наблюдают после прохождения через колонку 24 л сырья и после этого пропускание сырья прекращают. Аффинный сорбент промывают 10 л 0,1 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2 0,2) на 0,3 М растворе NaCl при скорости 2 л/ч. Затем через колонку пропускают 0,1 н HСl-глицериновый буфер (pH 3,0) при скорости 200 мл/ч, элюцию белка регистрируют ультрафиолетовым асорбциометром при длине волны 280 нм. По выхождении пика белка сбор вытекающего раствора прекращают и белоксодержащую фракцию нейтрализуют 0,5 н. NaOH при постоянном перемешивании раствора под контролем pH-метра до pH 7,20,2. Получают 42,8 мл раствора белка, содержащего 214 мг очищенного белка А с титром в РНГА 1:2560000. Полученный продукт дает отрицательную реакцию на присутствие стафилококковых токсинов в РНГА с антительным эритрацитарным диагностикумом при их титре в исходном материале 1:2560. Электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном геле в продукте очистки определяется одна узкая зона белка, соответствующая белку А по подвижности в электрическом поле. По сравнению с известным белком выполненым с тем же исходным сырьем, имеются существенные преимущества: выход активности белка А увеличен на 23%, удельная активность возрасла более, чем на 25%, полученный белок А более гомогенен, о чем свидетельствует малая ширина фракции при электрофорезе в полиакриамидном геле. Полученный по предлагаемому способу белок А свободен от стафилококковых токсинов. Пример 2. Выделение белка А производят в точном соответствии с примером 1 с тем отличаем, что сырье пропускают через аффинный сорбент до выхода фракции вытекающего раствора с активностью белка А в титре 1:2560 (1/2 исходного титра), расходуя при этом 59 л сырья. В результате более высокой степени насыщения сорбента почти в двое увеличивают выход массы и активности белка А в одном цикле при таких же параметрах качества, как в примере 1. Потери, наблюдаемые на стадии пропускания через аффинный сорбент, обратимы, так как остаточные количества белка А в вытекающем растворе (27% по активности) могут быть выделены в последующих циклах хроматографии. Выход активности по отношению к сорбированному количеству равен 93%. Таким образом, необратимые потери в ходе очистки равны 7%. В известном способе при этой же степени насыщения аффинного сорбента (до выхода фракции вытекающего раствора с титром белка А 1:2560) потери выше на 24%. Предлагаемый способ обеспечивает очистку от стафилококковых токсинов. Пример 3. Выделение белка А проводят, как в примере 1, с тем отличием, что для изготовления аффинного сорбента применяют IgG человека, который выделяют, очищают от антител к стафилококковым белкам и иммобилизируют на CNBr-активированной агарозе в точном соответствии с примером 1, используя такие же объемы реагентов в концентрации раствора. Через колонку с аффинным сорбентом пропускают 12 л исходного сырья с активностью белка А 1:5120 в РНГА. Элюированный глициновым буферным раствором (pH 3,0) белок А нейтрализуют. Получают 43 мл раствора белка А с активностью в титре 1:1280000 в РНГА при концентрации белка 2,57 мг/мл. Выход активности и удельная активность конечного продукта на 20% выше, чем в известном способе. Предлагаемый способ дает высокогомогенный белок А, свободный от стафилококковых токсинов. В порядке экспериментального обоснования эффективности предлагаемых технических решений выполняют способы выделения белка А с различными вариантами сорбентов и разными температурами прогревания сырья. Аффинный сорбент из неочищенных от противостафилококковых антител IgG свиньи, белка и человека не обеспечивают получение высокогомогенного белка А без примеси токсинов. При изготовлении аффинного сорбента из IgG свиньи, очищенного только от антител к стафилококковым антигенам, достигают некоторое повышение выхода активности, улучшение гомогенности целевого продукта и очистку от токсинов. Введение операции очистки IgG для аффинного сорбента от протеолитических ферментов дает эффект существенного улучшения гомогенности, повышения биологической активности и выхода целевого продукта по активности. Максимальный эффект по выходу, гомогенности и очистки от токсинов дает применение аффинного сорбента из IgG, предварительного очищенного от антител к стафилококку и протиолитических ферментов, в сочетании с прогреванием исходного сырья в интервале температур 80-90oC. Меньшие температуры (70oC) и более высокие (90oC) не обеспечивают оптимального эффекта. Представленные материалы показывают, что максимального выхода белка А по массе достигают при использовании IgG высокореагирующих видов (человека, свиньи) для приготовления аффинного сорбента. Применение для этих целей IgG низкореагирующего вида, IgG быка, дает минимальную производительность и низких выход белка А по причине низкого сродства к Fe-ферменту. Применение предлагаемого способа создает следующие преимущества: более чем на 20% повышается выход биологической активности белка А за счет снижения необратимых потерь; целевой продукт имеет более высокие параметры качества - более высокую удельную биологическую активность (примерно на 25%) и высокую гомогенность; в очищенном белке А полностью отсутствуют стафилококковые токсины; применение IgG высокореагирующих с белком А видов обеспечивает высокопроизводительную технологию его получения. Получение белка А более высокой активности, гомогенности с контролируемым отсутствием стафилококковых токсинов открывает возможности для более достоверного изучения его активности in vivo и для конструирования лечебных препаратов на его основе. Для осуществления предлагаемого способа требуются дополнительные материалы и трудозатраты.
Формула изобретения
1. Способ получения очищенного белка А золотистого стафилококка, включающий приготовление аффинного сорбента путем иммобилизации иммуноглобулинов класса G млекопитающих на нерастворимом корпускулярном носителе, контактирование исходного сырья с аффинным сорбентом, промывку сорбента от примесей и элюцию белка А, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, биологической активности белка А и чистоты, аффинный сорбент готовят из нормальных сыровороточных IgG свиньи или человека, причем перед иммобилизацией IgG его очищают от антител к экстрацеллюлярным антигенам стафилококка и от протеолитических ферментов, далее перед контактированием с аффинным сорбентом исходное сырье прогревают при 80 - 90oC 30 мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для очистки IgG от антител к экстрацеллюлярным антигенам стафилококка используют иммуносорбент с иммобилизованными концентрированными растворимыми компонентами культуры штамма-продуцента, предварительно очищенными от белка А. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что для очистки IgG от протеолитических ферментов используют аффинный сорбент с иммобилизованным овомукоидом.MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 24.12.2004
Извещение опубликовано: 10.07.2008 БИ: 19/2008
