Способ получения гликопротеина

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (Я) (Н) А3 (59 4 G 01 N 33 50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2745898/28-14 (22) 19, 03. 79 (23) 20.03.78 (31) 31999/78 (32) 20. 03. 78 (33) JP (46) 15.10.88,Бюл. У 38 (71) Моринага Милк Индастри Ко, Л т.д и Дзе Грин Кросс Корпорейшн (Р2 (72) Фумимара Такаку, Кацухиро Огаса, Морис Кубояма, Минору Санто, Масаюки

Нисида, Сатоси Фунакоси, Нобуя Янаи

- и Мунео Ямада (JP) (53) 616. 07 (088.8) (56) Proceeding of the National

Academy of Science 56, р.488, 1966. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА путем удаления нерастворимых веществ из мочи человека, обработки ее хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, с последующей очисткой гель-фильтрацией на Сефадексе G-150, о т л и— ч а ю шийся тем,что, с целью повышения специфичности способа при ,получении гликопротеина, способного

:стимулировать образование гранулоцитов человека, пробу мочи предварительно подвергают хроматографии на силикагеле при элюировании 5Х-ным раствором аммиака, элюат нейтрализуют раствором серной кислоты, а затем насыщают до 70Х сульфатом аммония, полученный при этом осадок растворяют в воде, затем пропускают через колонку с СМ-Сефадексом G-50, полученный элюат подвергают хроматографии на

ДЕАЕ-целлюлозе при элюировании

0,1 М трис-НС1 буферным раствором рН 7,0, содержащим 0,3 М НаС1, полученный после этой процедуры элюат вновь подвергают хроматографии на

ДЕАЕ-целлюлозе при элюировании в градиенте концентрации раствора хлористого натрия от 0,001 до 0,3 М, элюат подвергают высаливанию сульфатом аммония, полученный осадок растворяют в воде, раствор подвергают гель-фильтрации на Сефадексе G-150 и адсорбции на конкавалин А Сефароза 4 В с последующим элюированием 50 м раствором а(;метил-D-глюкозида, элюат подвергают очистке с помощью препаративного зонного электрофореза, а. целевой продукт получают элюированием 0,025 М трис-0,192 глициновым раствором.

1431691

Изобретение относится к медицине, а именно к получению гликопротеина.

Целью изобретения является повышение специфичности способа при получе5 нии гликопротеина, способного стимулировать образование гранулоцитов человека НС3-гликопротеин за счет обработки мочи методом хроматограФии на силикагеле, CM-сефадексе G-50

ДЕАЕ-целлюлозе, гель-фильтрации на ефадексе G-150, адсорбции на конка9алин А Сефароза 4В с последующей чисткой с помощью зонного электроopesa. 15

Способ осуществляют следующим образом.

Свежую мочу, собранную от нормальйых людей, доводят до рН 6-9, пред йочтительно 7-8, разбавленными раство-20

1 ами кислоты или растворами щелочи и фатем центрифугируют для удаления нерастворимых примесей, содержащихся в моче. Верхний слой контактирует с кремнийсодержащим адсорбентом, таким 25 как силикагель, силикагель-силикат магния, диатомитбвая земля, кварц или бентонит, и адсорбированные составные

9асти элюируют щелочным раствором предпочтительно при рН 9 или выше 30 (щелочный раствор, который используфт для элюации, не является специальь ым, это предпочтительно водные раст° ° ° ° оры гидроокиси аммония, гидроокиси атрия и т,п. в концентрации 0,31,5 М). Затем доводят рН полученного элюата до 7-8 раствором кислоты и добавляют нейтральную соль, например сульфат аммония, до 70% насьпцения и получают фракцию сырого протеина, содержащего HG3-гликопротеин.

Полученную фракцию сырого протеина растворяют вновь в ма ой порции щелочного раствора, освобождают от низкомолекулярных веществ ультрафильтрацией, разбавляют соляным буферным раствором и приводят в контакт с катионным обменником например, карбоксиметилдекстраном,карбоксиметилцеллюлозой или Фосфоцеллюлозой для удаления примесей, содержащихся в растворе, в условиях нейтрального рН. Сырую Фракцию HG3-гликопротеина катионнообменник доводят до рН 68 предпочтительно 0,01-0,15 М соляными буферными растворами. Большая часть HG3-гликопротеина проходит через катионный обменник без адсорб" ции. Концентрированный выходящий продукт Уравнивают разбавленным буферным раствором с рН 6-8 и используют в ионно-обменной хроматографии. с анионным обменником, например, ДЕАЕцеллюлозой, который уравнивают таким же буфером, HGj-гликопротеин адсорбируется на анионном обменнике. Затем адсорбированный HG3-гликопротеин элюируют методом градиентного линейного концентрационного элюирования с использованием 0,1-0,3 M соляных растворов, например хлорида натрия.

HG3-гликопротеин элюируют при концентрации соли от 0 1 M и выше, но полное отделение затруднено, Отбирают фракции выходящего продукта при концентрации соли 0,1-0,3 M и при необходимости подвергают их обессоливанию и концентрационным обработкам. Для того, чтобы элюировать

НС3-гликопротеин из ионного обменникы, можно применять последовательное элюирование соляным раствором

0;1-0,3 M.

Для целей дальнейшей очистки объединенные фракции, полученные выше, очищают гель-фильтрационной хроматографией на сильно сшитом полимерНоМ геле, имеющем величину набухания в воде 10-20 мл/г, например Sepha-.

dex® G-150 или 3iogel® Р-100 и активные вещества извлекают 0,050,1 М соляным буферным раствором.

Фракции относительного объема выходящего продукта 1,11-1,60, предпочтительно 1,11-1,45 отбирают, обессо- ливают и концентрируют или лиофилизуют.

Пример 1. Доводят рН 400 л свежей мочи, собранной от нормальных людей, до 8 10%.-ным раствором гидроокиси натрия и центрифугируют с помощью непрерывного центрифугирования при 15000 об/мин при 0 С для удаления нерастворимых примесей.

Доводят рН поверхностного слоя до 7 с

10%-ным раствором соляной кислоты и пропускают через колонку с силикагелем (10 х 80 см). Вещества, адсорбированные на колонке, элюируют 40 л

5%-ного раствора аммиака. Доводят.до рН элюированного раствора 7,5 1 н. серной кислотой, добавляют сульфат аммония до 70% †íî насыщения и ото стаивают при 0 С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, растворяют в 2 л

5%-ного раствора аммиака, помещают в целлофановые трубки и проводят диа1431691 лиз на фоне 0,05 M фосфатного буферного раствора (рН 6,5). Диализованный раствор доводят до 10 л таким же буферным раствором и пропускают через ионообменную колонку CM-Sephadex :

Дк

G-50 (40х40 см), которая уравновешена 0,05 M фосфатным буферным раствором (рН 6,5), для адсорбции примесей на ионно-обменной смоле. 10 л вышедшего раствора концентрируют с помощью ультрафильтрационной аппаратуры на полых волокнах DI AFLO (фракционируемый мол. вес приблизительно

10000). Проводят диализ концентрированного раствора на фоне 0,1 М трисHCI буфера (рН 7,0) при 5 С в течение ночи. Диализованный раствор смеши. вают с 1 л такого же буферного раствора (полученный раствор — образец 1) 20

Указанный раствор пропускают через колонку с целлюлозой ДЕАЕ (4,0х х 40 см), которая уравновешена 0,1 М трис-НСI буфером (рН 7,0) и промывают колонку достаточным объемом

0,1 М трис-НСI буфера (рН 7,0). На наполненной колонке выполняют последовательное элюирование 0 1 М трисНСI буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,3 М хлористого натрия 30 (образец 2).

Диализованный раствор снова пропускают через колонку с целлюлозой

ДЕАЕ (4,0x40 см), которая уравновешена О,i M трис-НСI буфером (рН 7,0), и на наполненной колонке выполняют элюирование с линейным концентрационным градиентом хлористым натрием (0-0,3 M) . Активные фракции отбирают и добавляют сульфат аммония до 70Х насыщения. Осадки отделяют центрифугированием, растворяют в малом объеме 0,1 M трис-НСI буфера (рН 7,0) и.диализуют на фоне этого же буферно- -4 го раствора (диализованный раствор— образец 3).

20 мл диализованного раствора чис-. тят на колонке с Sephadex G-150 (4,0х х 60 см), которая уравновешена 0,1 М трис-HCI буфером (рН 7,0), и отбирают

50 полученные выходные фракции при отношениях V /V, 1,11 — 1,45, Объединенные фракции тщательно диализуют на фоне дистиллированной воды при 5 С и диализованный раст о «55 вор лиофилизуют с получением 500 мг порошка (этот полуочищенный HG3-гликопротеин — образец 4).

200 мг полуочищенного HG3-гликопротеина растворяют в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 1,0 М хлористого натрия, и пропускают через колонку со 100 мл конкавалина А-Sepharose-4В, которая уравновешена таким же буфером. После тщательного промывания колонки этим буфером

HG3-гликопротеин элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим

50 мл ы, -метил-D-глюкозида и 1,0 М хлористого натрия. Фракции которые способны к эффективному быстрому увеличению и дифференциации гранулоцитов, отбирают и диализуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют (образец 5).

Около 50 мг укаэанного лиофилизованного порошка растворяют в 1 мл

0,125 M трис-глицин буфера (рН 6,8), содержащего 102 глицерина. Проводят электрофорез полученного раствора при

;10 мА в условиях охлаждения с помощью препаративной электрофоретической аппаратуры, применяющей 8Х-ный акриламидный гель (рН 8,9, 20 х 25 мм).

Фракцию с относительной подвижностью

0,46 извлекают 0,025 M трис-глицино-. вым буфером (рН 8,3) и диалиэуют на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор лиофилизуют с получением около 10 мг HG3-гликопротеина (образец 6).

Пример.2. К 100 мг порошка ,HG3-гликопротеина (образец 6), полу:ченного таким же путем, как в примере

1, добавляют 100 мл водного раствора, содержащего 57 альбумина сыворотки крови человека и 17. глицина. Полу" ченный раствор стерилизуют с помощью

:фильтрационной системы, снабженной мембранными фильтрами с размером пор

0,45 мкм. По 1 мл стерилизованного раствора асептически вносят в пузырьки, которые стерилиэуют нагреванием при 180 С в течение 2 ч. После лиофилизации пузырьки герметично закры,вают, Таким образом, приготовили 95 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал 1 мг НЯ-гликопротеис

Пример 3. Таким же способом, как в примере 1, 1 л концентрировакного раствора, содержащего HG3-гликопротеин, аналогичного образцу 1, го товят из 1 000 л свежей мочи, собранной от нормальных людей. К этому

14316

Составитель

Редактор Л.Веселовская Техред А.Кравчук Корректор СтЧерни

Заказ 5358/59 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 концентрированному раствору добавля™ ют 10 л 0,1 М трис-НС1 буфера (рН 7,0);.

После тщательного перемешивания разбавленный раствор вновь концентрируют до 0,1 первоначального объема с помощью упьтрафнпьтраннонно аппаРату. ры на полых волокнах DIAFLÎ, К концентрированному раствору добавляют

5 л 0,1 M трис-НС1 буфера (рН,7,0) 10

И 5 л суспензии целлюлозы ДЕАЕ, содержащей 300 r сухой основной целлюю озы ДЕАЕ, которая уравновешена

9,1 M трис-НС1 буфером (рН 7,0).

Смесь перемешивают в течение 30 мин, 15 отстаивают в течение 10 мин и отфильтровывают под вакуумом на воронке Бюх

Нера, отделяя целлюлозу ДЕАЕ, Отоб". ранную целлюлозу ДЕАЕ промывают

0,1 M трис-НС! буфером (рН 7,0) и 20 новь отделяют фильтрацией таким же способом, как указано выше. Далее целлюлозу ДЕАЕ промывают 10 л 0,1 М трис-НС1 буфером (рН 7, О), содержащим 0,05 М хлористого натрия, и вновь 25 отбирают таким же способом, как указано выше. Обработанную целлюлозу

ДЕАЕ добавляют к 1 О л 0,1 M трис-НС!. буфера (рН 7,0), содержащего 0,3 М хлористого натрия, и перемешивают, 30 чтобы освободить HG3-гликопротеин от целлюлозы ДЕАЕ. Смесь отфильтровывают таким же способом, как ука91 б зано выше, и отбирают отфильтрованный раствор. Отфильтрованный раствор обессоливают ультрафильтрацией на полых волокнах DIAFLO. Обессоленный раствор лиофилизуют, отбирая 15 г порошка. Порошок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и очищают на колонке Sephadex G-150 (6,0х80 см), которую уравновешивают 0,1 M трисНС! буфером (рН 7,0). Отбирают фракции, которые соответствуют отношению

Чв/Vо 1,11-1,60. Проводят тщательный диализ объединенных фракций на фоне дистиллированной воды. Диализованный раствор концентрируют с помощью кон" центрационной аппаратуры на полых волокнах DIAFLO (тип ДС-2) до 100 мл концентрата, содержащего около 3 r сырого HG3-гликопротеина. Концентрированный раствор смешивают с I r глицина и 5 r альбумина сыворотки. Полученный раствор стерилизуют фильтраци" ей таким же способом, как в примере

1, и асептически заполняют порциями по 2,5 мл пузйрьки. После асептической лиофилизации пузырьки герметично закрывают. Таким образом, получено

40 пузырьков терапевтического агента для лейкопении, причем каждый пузырек содержал около 3,8 мг HG3-глико1 протеина.