Способ получения глицеролкиназы

 

Изобретение относится к области биотехнологии. Цель изобретения - упрощение процесса очистки и повьшение выхода целевого продукта. Способ предусматривает использование аффинной хроматографии на агарозном сорбенте с иммобилизованном красителем активным ярко-голубым КХ для вьщеления и очистки фермента. Гомогенат, полученный после дезинтеграции дрожжевой биомассы, подвергают тепловой обработке (10 мин при 60 с), отделяют коагулированный белок центрифугированием , хроматографируют на колонке с сефарозой 4Б с пришитым красителем активным ярко-голубым КХ. Фракции, содержащие глицеролкиназу, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюируют с нее 0,5 М раствором NaCl. 3 ил. 1 табл. i (О

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (51) 4 С 12 N 9/12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4207702/31-13 (22) 09.03.87 (46) 30.10.88. Бюл. и 40 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) И.Г.Моргунов, А.П.Ильченко и И.Т.Ермакова (53) 577. 15 (088.8) (56) Патент Великобритании У 1567606, кл. С 12 N 9/00, 1980.

Bergmeyer H. — U.Holz С. Kauc1er Е.М., Mollering Н., Wieland О.

Biochemische Zeitschrift, 1961, ч.333, р.471-480. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРОЛКИНАЗЫ (57) Изобретение относится к области биотехнологии. Цель изобретения - ynрощение процесса очистки и повьппение выхода целевого продукта. Способ предусматривает использование аффинной хроматографии на агарозном сорбенте с иммобилизованным красителем активнъпк ярко-голубым КХ для выделения и очистки фермента. Гомогенат, полученный после дезинтеграции дрожжевой биомассы, подвергают тепловой обработке (10 мин при 60 С), отделяют коагулированный белок центрифугированием, хроматографируют на колонке с сефарозой 4Б с пришитым красителем активным ярко-голубым КХ. Фракции, содержащие глицеролкиназу, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюируС> ют с нее 0,5 М раствором NaC1. 3 ил.

1 табл.

1433980

Изобретение относится к биотехно-! логии, а именно к способам получения ферментов, и может быть использовано в микробиологической, химической и медицинской промьппленности.

Глицеролкиназа (К.Ф.2.7.30) может применяться в качестве основного компонента реакционной смеси, используемой для определения глицерина при (его производстве в х имической промьппленности, при измерении потребления глицерина как субстрата в микробиологической промышленности. В медицине глицеролкинаэа используется для опре- 15 деления содержания триглицеридов в крови.

Цель изобретения — упрощение процесса очистки и повышение выхода фер мента глицеролкиназы„ 20

На фиг. 1 показана аффинная хроматография глицеролкиназы на иммобилизованном красителе активном ярко-голубом КХ (1 — концентрация белка, 2, удельная активность глицеролкиназы); на фиг. 2 — влияние рН на стабильность глицеролкиназы; на фиг. 3 — влияние рН на активность глицеролкиназы.

Способ заключается в том, что после тепловой обработки проводят аффинную хроматографию на сефарозе

1 4Б с иммобилизованным триазиновым

;красителем активным ярко-голубым КХ

I (rOCr 20447-75) . Краситель прочно . 35 .связывается с агарозной матрицей— с сефарозой, что обеспечивает возможность длительного использования сорбента лиганда.

Для выделения глицеролкиназы ro- 40 могенат, полученный после дезинтеграции дрожжевой биомассы (выращенной в питательной среде с глицерином), подвергают тепловой обработке (10 мин при 60 С), отделяют коа- 45 гулированный белок центрифугированием, хроматографируют на колонке с сефарозой 4Б с пришитым красителем активным ярко-голубым КХ. Фракции, содержащие активность глицеролкинаэы, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюируют с нее 0,5 М раствором

NaC1. Выход фермента составляет 6872% от содержания его в бесклеточном экстракте. 55

В предлагаемом способе фермент непрочно связывается с красителем и после нанесения на сорбент вымывается исходным буфером (фиг.1) ° Такой подход дает возможность еще больше упростить процедуру очистки и получить фермент без добавок элюирующих веществ, что позволяет наносить активные фракции на ионообменник для дальнейшей очистки без дополнительной обработки.

Пример 1. Дрожжи Candida va1ida Y-622 выращивают в среде Ридер с глицерином (1 ) в колбах на качалке. После культивирования. (16 ч) клетки собирают центрифугированием (4000 g, 10 мин), промывают 0,05 M фосфатным буфером (РН 6,0) и снова центрифугируют. Промытые клетки суспендируют в 0,05 M фосфатном буфере (pH 6,0), содержащем 10 мМ MgC1

10 мМ глицерина, 1 мМ ЭДТА (буфер А) в соотношении 10 мл буфера на 1 r дрожжей. Клетки разрушают путем продавливания на прессе из замороженного состояния. Неразрушенные клетки и клеточные стенки удаляют центрифугированием. Бесклеточный экстракт прогревают 10 мин при 60 С на водяной бане, коагулированный белок отделяют центрифугированием (4000 g, 20 мин).

Супернатант (5 мл) наносят на колонку (2,5 20 см), заполненную сефарозой 4Б со связанным красителем активным ярко-голубым КХ и уравновешенную буфером А.

Краситель связывается с сефарозой следующим образом. К 150 мл сефароэы добавляют 2,5 Na CO в 50 мл дистиллированной воды и 50 мл Z -ного раствора красителя, затем смесь инкубируют 40 ч при 45 С с перемешиванием, После инкубации гель переносят на воронку Бюхнера и отмывают сначала дистиллированной водой, затем 0,1 н, НС1 (0,5 л), снова водой 0,1 í. Na0H (0,5 л) и водой до нейтрального

РН (6). Полученным сорбентом заполняют колонку и уравновешивают буфером А.

Элюцию фермента с красителем проводят исходным буфером и собирают фракции по 2 мл (фиг,1), Фракции, содержащие активность глицеролкиназы, объединяют и наносят на колонку (1,5..> 20 см) с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенную буфером А. Фермент элюиру-. ют тем же буфером, содержащим 0,5 М

NaC1. Скорость элюции в обоих случаях 44 мл в час. Процедура очистки суммирована в таблице. Выход фермента составляет 72 от содержания в

Стадия очистки

Общий белок, мг

Удель- ная акОбщая активность

Выход, Х

Степень очистки, раз тивность

Е/мг белка

Бесклеточный экстракт

100

0,2

54,3 10 9

12 9,6

0,8

Прогрев

Аффинная хроматография

82 225

72 325

02 9 45

0 12 7 8 65

ДЭАЭ-сефароза

П р и м е ч а н и е. Белок определяют по Лоури.

1433 грубом экстракте, удельная активность

65 Е/мг белка. При электрофорезе в

ПААГ препарат глицеролкиназы дает одну минорную полосу. Фермент очищен в 325 раз. Активность глицеролкиназы

5 определяют в сопряженной реакции с глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой (7).

К объединенным фракциям, содержащим активность глицеролкиназы, добавляют для стабилизации фермента (NHq) S0+ до концентрации 2 М и этиленгликоль (10% по объему). В таком виде суспензия фермента готова к употреблению и стабильна в течение года.

Глицеролкиназа из Candida valida стабильна при рН 5,0-6,0 (фиг.2). Оптимальное значение рН для реакции фосфорилирования глицерина составляет 9,8 (фиг. 3) ° 20

В таблице дана процедура очистки глицеролкиназы из Candida valida.

Пример 2. В качестве источника глицеролкинаэы используют дрожжи 25

Gandida lipolntica 695 (BKM У-2378).

Культивирование дрожжей и выделение глицеролкиназы проводят по примеру 1.

Выход фермента составляет 68%, удельная активность 35 E/ìã белка, степень очистки — 116 раз.

Пример 3. В качестве источника выделения глицеролкинаэы используют дрожжи Saccharomyces cerevinae 354.

Культивирование дрожжей и выделение фермента проводят аналогично предыду- 35 щим примерам. Выход фермента состав980

1 ляет 70%; удельная активность 50 E/ìã белка; степень очистки — 220 раэ.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения глицеролкиназы и повысить выход продукта в 1,9-2 раза по сравнению с известным способом за счет сокращения числа стадий очистки и применения метода аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным красителем активным ярко-голубым КХ.

Способ позволяет значительно сократить продолжительность процесса очистки фермента.

Формула и э обретения

Способ получения глицеролкиназы, предусматривающий культивирование дрожжей на питательной среде, содержащей минеральные соли и глицерин, получение бесклеточного экстракта с последующим выделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хроматографии на слабоосновном анионите с полисахаридной основой в 0,05 M фосфатном буфере с рН

6,0 и элюцией 0,5 М раствором хлористого натрия в том же буфере, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода продукта, после тепловой обработки проводят аффинную хроматографию на сефарозе 4В с иммобилизованным триазиновым красителем активным ярко-голубым КХ.

1433980

l433980 а,s о 7 8 9 10 11 рн

Рце. Л

Составитель А.Карякин ! Редактор М.Петрова Техред М.Ходанич Корректор С.Черни

Заказ 5517/28 Тирам 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Уигород, ул. Проектная, 4