Способ получения иммобилизованного панкреатина

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химической, пищевой, легкой и медицинской отраслях промьшшенности.Целью изобретения является увеличение активности иммобилизации. Способ заключается в ковалентном связывании панк реатина с модифицированным эпихлоргидрином пектином. Модификацию проводят таким образом, чтобы при сшивке эпихлоргидрином содержание эпоксигрупп в пектине составляло 12,7 - 25,9%. Связывание проводят в среде с нейтральным значением рН, устанавливая соотношение модифицированного пектина и панкреатина, равное 1:0,12- 1:0,17. Предлагаемый способ позволяет упростить процесс и увеличить ак- «g тивность иммобилизованного панкреатина в 2 раза.. 1 табл. «Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (su 4 С 12 N 11/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4165732/31-12 (22) 23 ° 12.86 (46) 30.10.88. Бюл. Т1 40 (71) Институт органической химии

АН КиргССР (72) Б.M.Ìàíàåâ, З.Д.Ашубаева, И.А.Ямсков и В.А.Даванков (53) 577. 15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1013471, кл. С 12 N 11/04, 1981.

Манаев Б.М. Иммобилизация протеолнтических комплексов на пектинсодер- иащих носителях. — Прикл. биохимия и микробиология. В.1, 1985, XXI, с.59. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИМОБИЛИЗОВАН НОГО ПАНКРЕАТИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и мохет быть использовано в химической, пищевой, легкой и медицинской отраслях промышленности.Целью изобретения является увеличение активности иммобилизации. Способ заключается в ковалентном связывании панкреатина с модифицированным эпихлоргидрином пектином. Модификацию проводят таким образом, чтобы при сшивке энихлоргидрнном содерхание зпоксигрупп в пектине составляло 12,7—

25,97. Связывание проводят в среде с нейтральным значением рН, устанавливая соотношение модифицированного пектина и панкреатина, равное 1:О, 121:0 17. Предлагаемый способ позволяет упростить процесс и увеличить ак- ж тивность иммобилизованного анкреатина в 2 раза., 1 табл.

1433982

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химической, легкой и медицинской промьппленности.

Цель изобретения — увеличение активности иммобилизованного панкреатина и упрощение процесса иммобилизации.

Способ заключается в ковалентном ip связывании панкреатина с модифицированным эпихлоргидрином пектином. Модификацию эпихлоргидрином проводят так, чтобы при сшивке содержание эпоксигрупп в пектине составляло 12,725,9 ., так как при более низком содержании эпоксигрупп уменьшается ак-, тивность целевого продукта. Ковалентное связывание панкреатина проводят в среде с нейтральным значением рН, 20 устанавливая соотношение модифицированный пектин:панкреатин 1;О, 12—

1:0,17. Предлагаемый способ позволяет упростить процесс (3 стадии вместо

5 при общей длительности 5-6 ч вместо25

9,3), а также увеличить активность ! целевого продукта приблизительно в

2 раза. Приме р 1. К 1 г пектина приливают 1,5 мл эпихлоргидрина (ЭПГ), 30 д = 1, 18. Реакционный сосуд помещают в водяную баню с температурой 60 С и в течение 1 ч по каплям приливают

2 мл 25 -ного раствора NaOH при постоянном перемешивании. Реакция продолжается еще 1 ч при температуре, понижающейся с 60 до 35 С. Затем продукт промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и высушивают. Выход 88,2 от исходного веса 4р пектина.

Продукт не растворяется в воде, разбавленных (0,1 н.) растворах NaOH и НС1, содержит 25,9Х эпоксигрупп..

Сшитое эпихлоргидрином производ- 45 ное пектина в количестве 1 г подвергают взаимодействию с 0,12 г панкреатина в 10 мл воды (соотношение сшитый эпихлоргидрином пектин ПЭГ:панкреатин

1:0,12), перемешивают при 20 С в те50 чение 3 ч, отфильтровывают и промывают водой.

Ферментативную активность определяют с использованием низкомолекуляр ных субстратов — метилового эфира Lтриптофана и этилового эфира L-тиро55 зина на регистрирующем рН-стане (Kadiometer ТТТ-I С, Дания) в 0,1 М КС1 при 25 С.

Постоянное значение рН поддерживают добавлением в ячейку 0,01 М KOH (содержание карбонатов < 2 ).

Пример 2. 1 r пектина взаимодействует с 3 мл ЭПГ (d = 1,18) при добавлении по каплям 2 мл 25 -ного раствора NaOH в течение 1 ч на водяной бане с температурой 59 С. Реакция продолжается еще 1,5 ч при периодическом перемешивании и температуре, понижающейся с 59 до 35 С. Полученный продукт промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, сушат. Выход 101,6 . от исходного веса пектина. Продукт не растворяется в воде, 0,1 н. растворах НС1 и NaOH, содержит 19,8Х эпоксигрупп.

Сшитое эпихлоргидрином производное пектина (ПЭГ) подвергают взаимодействию 15 мг панкреатина (соотноо шение ПЭГ:панкреатин 1:0, 15) при 22 С в течение 3 ч, отфильтровывают и про" мывают водой..

Пример 3 ° Сшивку пектина производят эпихлоргидрином в щелочной среде при соотношении компонентов

1 r пектина и 4,5 мл ЭХГ в 2 мл 25Хного раствора NaOH при температуре о

60 С в течение первых 1,5 ч и температуре, понижающейся с 60 до 35 С, в течение последующих 1,5 ч. Затем продукт промывают водой до нейтральной реакции, сушат. Выход 107, 1Х от веса пектина. Продукт устойчив в водной, кислой и щелочной (0,1 н. ИаОН) средах, содержит 12,7Х эпоксигрупп.

Смешивают пектин с панкреатином (0,17 мг) в 10 мл воды в течение 3 ч о при 25 С, отфильтровывают и промывают водой. Ферментативную активность определяют аналогично примерам 1 и 2.

Пример 4 ° 1 г пектина сшивают эпихлоргидрином (б мл), добавляя по каплям 2 мл 25 -ного раствора

NaOH в течение 1 ч при температуре о

62 С. Реакция продолжается еще 1 ч при температуре, понижающейся с 62 о до 35 С. Полученное производное промывают водой до нейтральной реакции, сушат. Выход 101,7Х. Продукт устойчив в водной, кислой и щелочной (О, 1 н.

NaOH) средах, содержит 12,7Х эпоксигрупп.

Сшитое эпихлоргидрином производное пектина подвергают взаимодействию с 0,2 г панкреатина (протеолитический фермент) в 10 мл воды, перемешивают при 25 С 3 ч, отфильтровывают

1433982

Носитель .

Иммобилизованный панкреатин

Количество грамм эпихлор гидрина введенное в

1 r пек тина

Выход носителя от исПример

I олиество покси

Выход активАктивность, мкмоль/г носителя по скорости гидролиза

ИЭ L-триптофана групп в поли» мере, 7. ходного пектина, Ж ности панкреатина, Х

25,9 88,2 92,5

82508

1,77

1 ПЭХГ

2 ПЭХГ

3 ПЭХГ

4 ПЭХГ

19,8 101,6

12,7 107,1

5,4

91 0

80705

90,0

79000

5,3

12,7 101,7 79000

90,0

7,0

П р и м е ч а н и е. и = 25 С, (Sj = 10 М вЂ” начальная коно центрация субстрата, рН оптимум 8,0 для панкреатина.

ВН ИИПИ Заказ 5517/28 Тираж 520 Подписное

Произв-полигр. пр-тие,. г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и промывают водой. Ферментативную активность определяют аналогично приме рам 1 и 2.

В таблице приведены свойства пан5 креатина, иммобилизованного на пектинсодержащих носителях (ПЭХà — пектин эпихлоргидрин).

Как видно из таблицы, наиболее высокой относительной активностью 10 обладают препараты, содержащие 0,12 г панкреатина на 1 r носителя при соотношении носитель:фермент 1:0,15.Дальнейшее увеличение концентрации фермента ведет к понижению его каталити-15 ческой активности. Проведение процесса иммобилизации о при температурах более 25 С, как правило, приводит к неспецифической тепловой денатурации белковой молекулы фермента и потере вследствие этого каталитической активности а при тем- о

В пературе ниже 20 С связывание белка с носителем осуществляется неполностью. При взаимодействии полимера с эпихлоргидрином с повышением количества последнего в смеси происходит преобладание реакции сшивки перед этерификацией вторичных гидроксильных групп полигалактуроновой цепи.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс, проведя его в 3 стадии за 5-6 ч (вместо 5 стадий в течение 9,3 ч), а также увеличить активность иммобилизованного панкреатина в " 2 раза (от

47800 до 79000-82508 мкмоль/г носителя в час).

Формула изобретения

Способ получения иммобилиэованного панкреатина, включающий связывание панкреатина с модифицированным пектином и промывку иммобилизованного фермента водой, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью увеличения активности целевого продукта и упрощения процесса, используют пектин, модифицированный эпихлоргидри; ном, с содержанием эпоксигрупп 12,71

25,97, связывание проводят в среде с нейтральным значением рй, а соотношение модифицированный пектин:панкреатин равно 1:0,12-1:0,17. (