Способ получения листериозного антигена

 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, В частности к получению диагностических препаратов. Целью изобретения является повышение специфичности и активности антигена. Антиген получают после разрушения бактериальной суспензии методом баллистической дезинтеграции . Длительность дезинтеграции 2-2,5 ч. Частота колебаний стаканов дезинтегратора 3600 200 в 1 мин. Способ дезинтеграции позволяет использовать в антигенном препарате как поверхностные, так и внутриклеточные антигенные детерминанты. Центрифугируют дезинтеграт в режиме 10000+100 g в течение 20-30 мин. Лиофилизагщя антигена удлиняет срок его использования . Стандартизация по белку в пределах 3-3,3 мг/мл, остаточной впазнгности и данным ИК-спектроскопки повышает его качество. Полученный антиген по сравненяпо с коммерческим антигеном УНИИЭВ обладает более высокой активностью и специфичностью. Он выявляет все листариозные сьюоротки. Не реагит рует с нормальными и гетерологг1чными сьшоротками. 2 табл.

Саоз СОЕЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19I SUllfl

А1 (51) 5 А 61 К 39/02

ОПИСАНИЕ NSOEPETEHN !

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОЮИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАЮ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 15. 09.92. Бюл. N - 34 (21) 4079891/13 (22) 22.04.86 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (72) И,А.Бакулов, В.М.Котляров, В.F..Áåëoóñîâ. Д.А.Васильев, Л.В.Макеева и А.А.Цыганова (53) 616.078 (088.8) (56) Ветеринарные препараты. Под ред.Д,Ф.Осидзе, N. 1981, с.254-255. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИСТЕРИОЗНОГО

АИТИГЕНА (57) Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, в частности к получению диагностических препаратов. Целью изобретения является повьппение специфичности н активности антигена. Антиген получают после разруп ения бактериальной сус» пе н зии методом б аллистиче ской де зинтеграцин. Длительность дезинтеграции

2-2,5 ч. Частота колебаний стаканов дезинтегратора 3600 + 200 в 1 мин.

Способ дезинтеграции позволяет использовать в антигенном препарате как поверхностные, так и внутриклеточные антигенные детерминанты. Центрифугируют дезинтеграт в режиме 10000+100 g в течение 20-30 мин. Лиофилизация антигена удлиняет срок его использования. Стандартизация по белку в пределах 3 3 3 мг/млg остаточной 8I18. ности и данным ИК-спектроскопии повышает его качество, Полученный антиген по сравнению с коммерческим антигеном

УНИИЭВ обладает более высокой активностью и специфичностью. Он выявляет все лнстериозные сыворотки. HQ реаги». рует с нормальными и гетерологичныи сыворотками. 2. табл.

1441520

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии и может быть использовано для получения бактериальных диагностических препаратов.

Целью изобретения является повыше" ние специфичности и активности антигена.

Пример 1. Для изготовления антигена используют штаммы Ивйегха

monocytogeneJI 1-го(штамм 766) и 2-го (штамм 634) сероваров.

Расплодки бульонных культур листерий штаммов 1 и 2 сероваров (возраст 18-20 ч) засевают иа агар Д или

ИПЛ с 0 5-1Е глюкозы, разлитый в матровые колбы. Культивируют при 37 С я о течение 18-24 ч. Работу ведут параллельно с каждым штаммом в отдельности20 до стадии смешивания продукта, после стандартизации. Культуры листерий смывают с поверхности ИПА физиологи ческим раствором хлорида натрия рН

7, 2-7, 4. Трижды отмывают оТ Отстатков 2Я питательной среды путем центрнфугирования при 2000 8 в течение 25 мин.

Супернатант удаляют. Полученный осадок ресуспендируют в физиологическом растворе хлорида натрия {рН 7,2-7,4), 30 и, в сравнении с оптическим стандартом мутности, устанавливают концентрацию микробных тел в одном миллнлчтреот5z10 до15х10

Суспензию биомассы листерий в стерильньп условиях разливают в стаканы

;45 дезинтегратора, куда добавляют стеклянные бусы (диаметр бус 0,12 мм), и подвергают баллистической дезинтеграциио

1 "1

Условия и режимы дезинтеграции:. объем микробной суспензии в стакане .

25 мл; масса стеклянных бус 40 г (соответствует объему 25 мл); частзта колебаний стаканов дезинтегратора б

3600 в 1 мин; продолжительность дезинтеграции 120-150 мин.

Разрушенную бактериальную суспензию (дезинтеграт) нодверхают центри" фугированию при 10000 с в течение

25 мин. Суспернатант отделяют пипеткой в стерильный флакон H ипактнвируют мертиолятом в конечной концентрации 1 : 20000. Полученный ангиген, состоящий в основном из фракции ци- топлаэмы и мелких осколков клеточной

«стенки листерий, проверяют на стерильность,, Станпарти ируют по содержанию белка (3,0-,3 мг/мл) и ИК-спектроскопии (в диапазоне 780-1500 см ). Затеи образцы антигена, полученные из сероваров 1 и 2 > смешивают в равных пропорциях и разливают в стерильные ампулы по 1 мл. Замораживают в течение

48 ч при температуре минус 40 С, после чего проводят его сублимационную сушку. В сухом антигене определяют остаточную влажность, которая не должна превышать 37.

Цитоплаэменный листериозный антиген для PCK представляет собой белый порошок с желтоватым оттенком, хорошо растворяияцийся в физиологическом растворе.

П р и и е р 2. Для оценки специфической активности полученного антигена используют положительные и отрицательные (нормальные) сыворотки крови кроликов, овец и крупного рога" того скота.

Дополнительные компоненты реакции:

2.„.5Ж взвесь эритроцитов барана, коммерческий комплемент сухой для реакции связывания комплемента и гемолизин, физиологический раствор хлористого натрия p* - 7,2.

Реакцию связывания комплемента (PCK) с испытуемым антигеном в сравнении с коммерческим антигеном УНИИЭВ ставят согласно наставлению по лабораторной диагностике листериоза животных

Перед комиссионным опытом участвующие в реакции пробы положительных и отрицательных сывороток зашифровывают. Результаты испытаний представлены в табл, 1 и 2.

Как видно иэ табл. 1 н,2, предлагаемый антигеи в сравнении с .коммерL ческим обладает .более высокой активностью и специфичностью: выявляет все листериозные сыворотки и не реагирует с нормальными и гетерологическими сыворотками,.

Таким образом, способ изготовления лнстсриозного антигена для РСК обеспечивает (по сравнению с известным способом) получение высокоактивного н высокоспецнфического диагностикума, что позволяет резко повысить достоверность результата РСК при листерио-, зе. Разработанный режим лиофнлизапии полученного диэентеграта позволяет выпускать препарат в сухом виде, что увеличивает сро".с его использования

Таблица

Результаты кОмиссионньгх l.спытаний активности и чувствительности листериозного антигена для

РСК и коммерческого антигена УНЯВ с заведомо положительными листериоэ!!ыми с!!норотками

Кол"во проб листериоэных сывороток

Время уче- Резуль-аты РСК та реакции

j noJtoRH жи!!итель отрицатель

I. тельный j nbi. E ный

Антигеи

44

Сразу

Предлагаемый

Через 1!! ч 44

Коммерческий

УНИИ ЭВ

Через 18 ч

Таблч! а 2

Результаты комиссионных lie. !таний спец. фичности листериозного а«т!!генa для РСК и коммерческого антил!!!а УНГ!ЗВ с заведомо отрицательными и гpTppG;toãè÷tlûèè сыворотка !!!

Время уче- l! та р е акции,, Попоил!» тельный

Кол-во проб норРезультаты РСК

Кол-во проб гетеРОЛОГИЧHbtX

CblB0P07OK

Антиген

Отрицательный

С l.!НИмальных сывороток

164

Предлагаемый 166

Сраз г 66

Чере 18 .!

Чер-э 15 ч

3 14415 до 3 лет (срок наблюдения). применяемые критерии стандартизации препарата, включающие показатели белка, остаточной влажности ИК-спектроскопии позр р и воляют контролировать выпуск стандартного антигена, что повышает его качество.

Формула изобретения

Способ получения листериоэного аптигеиа, включающий раздельное культивирование штаммов Listeria щопосуtogenes 1-го и 2-ro сероваров, приготов» ление микробных суспензий, выделение

1 иэ них:!:ртиген!!ых детерминант, очистку каждой жидкой фракции в центробекном поле с получением супернатанта, с последующим их смешиванием в соотношении 1 l 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повьппения спв цифнчностп и активности целевого прО дукта, выделение антигенных детерми

íaнт осуществляют путем баллистическай дезинтеграции микробной суспенз и;-„О раэрущения клеточных стенок, а О-!истку недуг при факторе разделени.; †: 10000...10100 g в течение 203P Et!,;;, 6

Продолжение табл,2 441520

Рез льтаты РСК

Антиген

Время уче та реакци

4Ф

Х

»Ф Ф» Ю Э

Положи- Сомни- Отрицательтельный тельный ный

Сразу 13

Коммерческий 1бб

146

Через 18 ч 0

Сразу 0

Через 18 ч 0

Составитель В.Романова

Редактор T,éèëèíåíêî Техред Л.Олийнык Корректор В.Бутяга

3ФЙДВЬФ» Ь юь»»»»

Ю» ! ирам Подписное

1

ВНИИПИ Государстввнногю комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4063 !

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул Проектная 4

Кол-so проб нормальнъпс сывороток

Кол-во проб .гетерологичных сывороток