Способ получения замещенных андроста-1,4-диен-3,17-дионов

 

Изобретение относится к производным природных стероидов, в частности к получению замещенных андроста-1,4-диен-З,17-дионов формулы I .Сн, ж О СЫгде К ., -И или С |-С -алкшт, которые проявляют сильное ингибирующее действие на ароматозу в лабораторных условиях и высокую активность в живом организме. Цель изобретения - выявление новых более активных соедине НИИ. Получение их ведут дегидрогенизацией соответствунмцего 1,2-дигидропроизводного соединения формулы I с помощью агента дегидрогенизации в органическом расгворителе при температуре кипения с обратным холодильником . 1 табл. . (У) С

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕаЪБЛИН (5g 4 С 07 3 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К IlATEHTY

О

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4027793/23-04 (22) 08.07.86 (31) 8517360 (32) 09.07.85 (33) СВ (46) 30.11.88. Бюл. У 44 (71) Фармиталиа Карло Эрба

С.п.А. (IT) (72) Франко Буззетти, Натале .

Барбугьян, Паоло Ломбарди и Энрико ди Салле (1Т) (53) 547.689.6.07(088.8) (56) Патент США М 4322416, кл. 424-242, 1975.

Патент Великобритании Р 929985, кл. 2 (ЗС), 1968.

Рингольд Г.Дж. и др. Химия и про. мышленность, 1962, с..211. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАИЕЩЕННЫХ

АНДРОСТА-1, 4-ДИЕН-З, 1 7-ДИОНОВ (57) Изобретение относится к производным природных стероидов, в част„SU „„442077 А 3 ности к получению замещенных андроста-1,4-диен-3,17-дионов формулы Х где R. -Н или С "С -алкил, которые проявляют сильное йнгибируюцее действие на ароматозу в лабораторных условиях и высокую активность. в живом организме. Цель изобретения — выявление новых более активных соедине" ний. Получение их ведут дегидрогенизацией соответствующего 1,2-дигидропроизводного соединения формулы I с помощью агента дегидрогенизации в органическом растворителе при температуре кипения с обратным холодильником. 1 табл.

1442077

Изобретение относится к способу получения новых замещенных андроста-1,4-диен-3,17-дионов, а именно б-.алкилиденандроста-1,4-диен-3,17«

-дионов общей формулы (I)

О

О

II

СН2 ,15 где К„ — водород или С,-с+ алкил, Предлагаемые соединения проявляют сильное ингибирующее действие на ароматазу в лабораторных условиях и обладают исключительно высокой эффективностью действия в живом организме благодаря своей более высокой метаболической стабильности по срав- 25 нению с известными соединениями ана логичной структуры„

Пример 1. 0,50 r 6-метилен андроста-4-ен-3,17-диона и 0,57 г дихлорцианобензохинона (ДДХ) подвер- 30 гают дефлегмации в 20 мл безводного диоксана в течение примерно 15 ч.

Для того чтобы удалить ДДХ, суспензию фильтруют через окись алюминия. После выпаривнния растворителя остаток растворяют в этилацетате, органический слой промывают водой, сушат над сульфатом натрия и растворитель удаляют под вакуумом. Неочищенный продукт подвергают хроматографии на 40 силикагеле, используя смесь гексан/ этил ацетат 40% с тем, чтобы получить в результате 0,25 г чистого 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона, температура т.пл. 188-191 С, Я макс.

247 мр(E 13,750) .

Найдено, %.: С 81,01; Н 8,05.

С .Н .О <

Вычислено, %: С 81,04; Н 8,16, В соответствии с описанной процедурой были получены следующие соединения.

i-Ìåòèë-б-метиленандроста- I 4Ъ

-диен-3 17-дион, т,пл. 178-180 С, Найдено, %: С 81,18; Н 8,37.

С„Н„О, Вычислено, % . С 81,25; Н 8,44, 1-Этил-б-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диен.

Найдено, %: С 81,32; Н 8,62.

С„Н,,О, Вычислено, %: С 81,44; Н 8,70, 4-Метил-б-метиленандроста-1,4диен-3,27-дион.

Найдено, % С 81,15; Н 8,32 °

С Н ьО

Вычислено, %.: С 81,25; Н 8,44.

Пример 2. Смесь 6-метиленандроста-4-ен-3,17-диона (0,50 r), двуокиси селена (0,50 г) и трет-бутилового спирта (200 мл) нагревают до температуры дефлегмации в атмосфере азота в течение примерно 30 ч.

Охлажденный раствор фильтруют, а затем выпаривают до сухого состояния при пониженном давлении. Остаток переносят в этил ацетат (100 мл), обрабатывают древесным углем и промывают последовательно водой, раствором сульфида аммония, холодным 1?% раствором гидрата аммония, холодной разбавленной хлористоводородной кислотой, водой, сушат с сульфатом натрия и наконец выпаривают до сухого состояния. Неочищенный продукт подвергают хроматографии в соответствии с описанием приведенным в примере в результате чего получают 0,20 r чистого б-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона, температура т.пл. 188191 С.

Следуя той же процедуре получали следующие соединения.

1-Метил-б-метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион.

Найдено, %: С 81,16; Н 8,37.

С,,H Ð, Вычислено, %: С 81,25; Н 8,44.

1-этил-б-метиленандроста-1,4-диен-3 17-дион.

Найдено, %: С 81,32; Н 8,62.

С,Н„О, Вычислено, %: С 81,44; Н 8,70.

4-Метил-б-метиленандроста-1,4-диен-3,17-дион.

Найдено, %: С 81,15; Н 8,32.

С аЬ О

Вычислено, %: С 81,25; Н 8,44.

Пример 3. Раствор диметил лития меди получают в атмосфере азота при помощи добавления 1,6 М раствора в простом эфире метил лития в шлам иодида одновалентной меди в о безводном простом эфире при 0 С.

Раствор перемешивают при ООС в тече/ ние 20 мин, а затем в течение 20 мин

144207 добавляют 54-андрост-1-ен-3, 17-дион в безводном тетрагидрофуране и перемешивают еще в течение ЗО мин. Смесь сливают- в насыщенный водный раствор

5 хлорида аммония, затем добавляют бензол и полученную в результате смесь быстро фильтруют через гиатомовую землю. Органический слой промывают водным раствором хлорида аммо- 10 ния, водой, сушат над сульфатом магния и выпаривают до сухого состояния. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, используя смесь гексан-этил ацетат 10-20, в резуль- 15 тате чего получают 1р-метил-5d -андроста-3,17-дион.

ИК (KBr) 17 10 см (3-оксо);

1740 см (17-оксо).

В раствор 1р-метил-5c(-андроста- 20

-3,17-диона (3,025 г 10 ммоль) в ледяной уксусной кислоте (100 мл) о по каплям при 20-25 С при энергичном перемешивании добавляют раствор брома (1,60 г, 10 ммоль) в ледяной ук- 25 сусной кислоте (30 мл), содержащей одну каплю 47 раствора HBr. Бром расходуется в течение 20 мин. .Полученный раствор сливают в воду и полученный в результате оса- 30 док собирают, тщательно промывают водой и сушат под вакуумом, в резуль-. тате чего получают 3,82 г (100 ) неочищенного 4-бром-1р-метил-5-o(-андроста-3 17-диона.

ИК (KBr) 1740 см (З-оксо,17-оксо).

Раствор неочищенного соединения брома, полученного в соответствии с описанием, в диметилформамиде 40 (100 мл) перемешивают с высушенным о хлоридом лития (7 r) при 140-150 С.

После охлаждения раствор сливают в воду и полученный в результате масJIHHHcTbIH продукт экстрагируют с ис 45 пользованием простого эфира. Оргагический слой промь|вают 10 .-ным В ! раствором хлористоводородной кислоты и водой„ сушат, а затем выпаривают под вакуумом. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, используя смесь гексан-этил ацетат 10 30 в результате чего получают 2,4 г (80 ) 1-р-метил-андрост-4-ен-3,17диона. 55

ИК (KBr) 1620 (3 ); 1660 (3ОКСО); l735 см (17-оксо).

Смесь ацетата натрия (1 г), абсолютного хлороформа (30 мл), форм7

4 алъде гида-диэтилаце таля (30 мл, 0,24 моль), фосфорил хлорида (3,8 мл, 0,04 моль) и 1р-метил-андрост-4-ен-3,17-диона (0,811 r 2,7 моль) перемешивают при температуре дефлегмации в течение примерно 7 ч, т,е. до тех пор, пока не исчезнет исходный материал, Суспензии дают возможность охладиться и при энергичном перемешивании по каплям добавляют на сыщенный раствор карбоната натрия до тех пор, пока рН водного слоя не станет щелочным (примерно 1 ч). Органический слой отделяют, нейтрализуют водой и сушат при помощи сульфата натрия. После концентрации при пониженном давлении маслянистый остаток подвергают хроматографии на силикагеле, используя смесь гексан-этил ацетат в качестве элюента. Таким образом получают чистый 1 -метил-6-метиленандрост-4-ен-3,17-дион с 60 выходом (О, 195 r) .

ИК (КВГ): 3100 (6 = СНn) 1735 (17-оксо); 1680 (3-оксо); 1630, 1660 см (и 6 = СН ).

П р и и е р 4. Раствор андрост-4-еН-3,17-диона в трет-бутаноле нагревают до кипения и в кипящий раствор добавляют трет-бутилат калия в трет-бутаноле, Затеи медленно добавляют метил хлорид в трет-6>Таноле. Раствор охлаждают, подкисляют концентрированной хлористоводородной кислотой и разбавляют водой. Избыток трет-бутанола удаляют под вакуумом и водный слой экстрагируют этил ацетатом. Соединенные экстракты промывают водой, сушат над сульфатом магния и выпаривают под вакуумом.

Остаток подвергают хроматографии на силикагеле и элюируют смесью гексан-этилацетат. Элюент выпаривают и остаток кристаллизуют из простого эфира, в результате чего получают

4-метиландрост-4-ен-3, 17-дион °

ИК (KBr): 1735 (17-оксо), 1660 (З-оксо), 1620 см (д4).

В качестве альтернативы смесь андрост-4-ен-3, 17-диона, тиофенола, 40 -ного водного раствора формальдегида, триэтиламина и этанола нагревают до температуры дифлегмации в течение примерно 48 ч. Охлажденньб раствор сливают в водный раствор гидрата окиси натрия, а продукт изолируют при помощи экстрагирования простым эфиром. Эфирные экстракты

5 144 промывают водой и сушат над сульфатом магния. Полученный в результате, остаток растирают с гексаном с тем, чтобы удалить любые побочные продукты конденсации, образовавшиеся иэ тиофенола и формальдегида. 4-Фенилтиометиландрост-4-ен-3,17-дион, полученный таким образом, подвергают десульфуризации при помощи растворения в ацетоне и добавления в суспензию Никеля генея в кипящем ацетоне. Смесь подвергают дефлегмации в течение примерно 5 ч при перемешивании. Горячий раствор фильтруют и катализатор промывают кипящим этанолом и водой, Соединенные фильтры подвергают концентрированию под вакуумом, при этом продукт отделяют в виде твердой массы, В результате рекристаллизации из смеси ацетонгексан получают 4-метилен-дрост-4-ен-3,17-дион.

Смесь ацетата натрия (1 г), абсолютного хлороформа (30 мл), диэтил ацеталь формальдегида (30 мл, 0,24 моль), фосфорил хлорида (3,8 мл, 0,04 моль) и 4-метил-андрост-4-ен«3, 17-диона (0,81 r 2,7 ммоль подвергают дефлегмации в течение примерно 7 ч, т.е. До того момента, пока не прореагирует весь исходный материал. Суспензии давали возможность охладиться и при энергичном перемешивании по каплям добавляют насыщенный раствор карбоната натрия до тех пор, пока рН водного слоя не станет щелочным (примерно 1 ч). Органический слой отделяют, нейтрализуют водой и сушат над сульфатом натрия. В результате концентрирования,при пониженном давлении получают маслянистый остаток, который подвергают хроматографии на силикагеле, .используя смесь гексанэтил ацетат в качестве элюента.

Таким образом получают чистый

4-метил-б-метиленандрост-,4-ен-3,17-дион с выходом 60Х, ОК (KBr) 3080 (6-СН ), 1735 (17-оксо), 1665 (Ç-оксо), 1635, 1595 см (4 = 6 = СН ).

Пример 5. Таблетки, каждую весом 0,150 r и содержащую 25 мг активного материала, получают следующим образом.

Состав (для 10 000 таблеток), г:

6-Иетиленандроста-1,4-диен-3, 17-дион 250

Лактоза 800

2077 6

Кукурузный крахмал 415

Порошкообразный тальк ЗО

Стеарат магния 5

Перемешивают б-метиленадроста-1,4-диен-3,17-дион, лактозу и половину количества кукурузного крахмала, затем смесь просеивают через сито с

1р размером отверстий 0,5 мм. Кукурузный крахмал (10 г) суспендируют в теплую воду (90 мл) и полученную в результате пасту используют для гранулирования порошка. Гранулят сушат, просеивают через сито с размером отверстий 1,4 Ъм, затем добавляют остаточное количество крахмала, тальк и стеарат магния, все это тщательно перемешивают и прессуют в таблетки.

20 Пример 6. Капсулы, каждая из которых содержит дозу 0,200 г и

20 мг активного материала, получают следующим образом.

Состав для 500 капсул, r:

25 6-Иетиленандроста-1.,4диен-3, 17-дион. 10

Лактоза 80

Кукурузный крахмал 5

Стеарат магния 5

30 Эту композицию помещают в желатиновые капсулы, состоящие из двух половин, каждая капсула содержит дозу в 0,200 г.

Ингибирование ароматазы при помо щи предлагаемых соединений (испытывалось как in vitro (ароматаза плаценты человека) так и in vivn (активность ароматазы яичников) на крысах.

40 В качестве примера активность б-метиленандроста-1,4-диеí-3 17-диона (внутренний код F CE 24304) и 1-метил-б-метиленандроста-1,4-диен-3,17диона (внутренний код Р СЕ 25027)

45 сравнивали с активностью хорошо известных ингибиторов ароматазы: 4-окси-андрост-4-ен-3,17-диона (40H-А), р 1- тестололактона и андроста-1,4-диен-3,17-диона. бп 6-Иетилен-андрост-4-ен-3,17-диона был предложен в качестве эффективного промежуточного соединения при получении ценного с терапевтической точки зрения бо(-метилового стероид55 ного гормона, однако какой-либо терапевтической ценности самого соединения не было отмечено.

А. Ингибирование ароматазы в лабораторных условиях in vitro.

42077

7 !4

Ферментную систему изолировали из микросомальной фракции ткани человеческой плаценты в соответствии со стандартным приемом. Использовали аналитический метод Томпсона и Сиитери.(с тем, чтобы определить скорость ароматизации, в соответствии с которым определяют высвобождение З Н О э

3 у из 4-(1p, 2 P — Н) андростен-3,17-диона. Все стадии инкубации осущест-! вляли в водяной бане при встряхивании и 37 С на воздухе в буфере 10 мм фосфата калия, рН 7,5, который содержал

100 мм KCl, 1 мИ ЭДК и i мМ дитиотрейтола.

Эксперименты проводили в 1 мл объема инкубации, содержащем 50 нИ

4-(Н) андростендиона, различные концентрации ингибиторов, 100 мИ И АДРН и 0,05 мг микросомальных протеинов.

Через 15 мин инкубации реакцию прекращали при помощи добавления хлороформа (5 мл). После центрифугирования со скоростью 1500 g в течение 5 мин отдельные порции (О 5 мл) извлекали из водной фазы с целью определения концентрации образовавшейся Н О.

Концентрацию каждого соединения, необходимую для уменьшения ингибируемой ароматазы íà 50Х (ИКу,), определяли при помощи построения графика в координатах ингибирования в процентах и log концентрации ингибитора. Относительную активность каждого соединения к 4 ОН-А вычисляли в соответствии с соотношением:

HE для 4 0Н-А

Относительная 5о активность

ИК испытываемого соединения росомы извлекали из яичников и их активность ароматазы определяли.с использованием приема, аналогичного тому, что был описан в А.

Инкубацию осуществляли в течение .

30 мин в 2 мл объема инкубации, содержащем 0,1 мг микросомальньм протеинов, 100 нИ 4-(аЧ) аидростендиона

10 и 100 мИ N АДРН, Ингибирование в процентах активности контролируемой ароматазы рассчитывали на основе полученных данных согласно таблице.

Новые соединения под кодом

15 Р СЕ 24304 и FCE 25027 являются очень сильнйми ингибиторами ароматазы.

В оральных испытаниях in vivo новые соединения были очень эффективными, что являлось следствием

20 его уникальной стойкости относительно апатического обмена веществ в то время, как соединение 4-ОН-А оказывалось неэффективным.

Острая токсичность (ЛД ) предлагаемых соединений, при применении к мьппам, определенная в результате разового применения возрастающих доз и измеренная на седьмой день после применения, оказалась пренебрежиЗ0 мо малой. Например, значение ЛД для предлагаемых соединений Г СЕ

24304 и F СЕ 25027 вьппе, чем

800 мг/кг при оральном применении на мышах.

Формула изобретения.

1. Способ получения замещенных андроста-1,4-диен-3,17-дионов общей формулы

Б. Ингибирование ароматазы в живом организме (на крысах) (in vivo)

Взрослых самок крысы дважды обрабатывали подкожным способом при помощи 100 м.е. гонадотропного гормона сыворотки беременных лошадей (ГСБЛ) с интервалом в 4 дня с тем, чтобы увеличить активность ароматазы яич- Б0 ников в соответствии с процедурой, описанно@ A.M.Ã.Áðoäè и др., Stегоids.

Через 3 дня после второй обработки при помощи ГСБЛ группам по 6 животных 55 в каждой давали стоматическич способом растворитель (0,5Х метосел) или ингибитор в концентрации 30 мг/кг.

Животных усыпляли спустя 24 ч, микгде R — водород или С -С -алкил, отличающийся тем, что осуществляют дегидрогенизацию соеди-, нения общей формулы

СНз

Ъ где Р. имеет указанные значения, с помощью агента дегидрогенизации в органическом растворителе при температуре кипения с обратным холодильником.

1442077

В лабораторных условиях (in vitro) В мивом организме (in vivo) Соединение

ИК,, Относительнм ная активность

4-0кси-андрост-4-ен-3, 17-дион (4-ОН-А) 44 (1,00) по определению

Неактивный е -Тестололактон (тестолактон) 8240 (0,005) Неактивный

6 Метиленандрост-4-ен-3,17-дион

74 (0,59) Неактивный

Андроста-1,4-диен-3,17-дион

112 (0,39) 37

81 (1,13) 39

29 (1,52) Редактор А. Долинич

Тиразк 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауюская наб., д. 4/5

Заказ 6298/58

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

6-Метнленандрост»1, 4-диен-3,17-дион (F СЕ 24304) 1-Метил-6-метиленандроста

1,4-диен-3 17-дион (F СЕ 25027) Ингибироввние ароматазы, Х, в дозе 30 мг/кг через- рот

Составитель И. Федосеева

Техред А.Кравчук Корректор С. Ыекмар