Способ биотинирования нуклеиновых кислот

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и в медицине для неради.оактивного мечения нуклеиновых кислот. Целью изобретения является увеличение чувствительности индикации меченных биотипом ДНК при дот-гибридизации . Биотин присоединяют к нуклеиновой кислоте в две стадии. При этом на первой стадии присоединяют соединение , содержащее фотоактивируемую группу и полимерную цепочку с поло- , жительно зар.чженнон амнчогруппой на конце, а именно Н-(ч-азидо-2-нитробеизоил) днамниогептан, а на второй - бифункциональный реагент, содержащий биотин и взаимодействующий с аминогруппой, а именно N-окснсукцинимидный эфир биотинил- -аминокапроновой кислоты. Для реализации способа синтезирован фотоактивируемый fiearcHT Н-(4-азндо-2-нитробензоил)-1,7-диаминогептан. Налнчне положительного заряда на первой стадии и его блокирование на второй обеспечивает высокий уровень ковалентного присоединения биотина к ДНК и снижение неспецифической сорбции. Способ и синтезированный для его реализации реагент позволяют та1сже увеличить расстояние между фотоактивируемой группой и биотипом, что повышает чувствительность. Применение биотинированной предлагаемьм способом ДНК для гибридизации позволяет выявлять до гомологичной ДНК, причем негомологичная ДНК в количестве ТО г не выявляется. с со (Л CZ Harfb . 05

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСВЧЬЛИН (51) 5 С 12 N 15/00

>1" ф,ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И -А ВТС»РСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 23, 09. 90. Бюл. У 35 (21) 4220383/28-13 (22) 13. 09. 8.7 (71) Институт медицинской генетики

АИН СССР (72) А.В.Карпухин, Н.Н.Вейко, А.Г.Салимов и Д.И.Спитковский (53) 661 (088.8) (56) А.С.Forster, X.G.Mc. Innes, D.Ñ.Skingle and R.H.Symons. Nucl.

Acids. Res, 1985, v. 13, К 3, 245761. (54) СПОСОБ БИОТИНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и .в медицине для нерадиоактивного мечения нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является увеличение чувствительности индикации меченных биотином ДНК при дот-гибридизации. Биотин присоединяют к нуклеиновой кислоте в две стадии. При этом на первой стадии присоединяют соединение, содержащее фотоактивируемую группу и полимерную цепочку с полоBU» 443494 А 1 жительно заряя енно«» аии «огруппой на конце, а именно й-(4-азндо-2-нитробенэоил)-1,7 днами««огепта««, а на второй — бифункциональный реагент, содеркащи«» биотин и взаимодействующий с аминогруппой, а именно К-окснсукцинимидный эфир биотин»»л-Е-аминокапроновой кислоты. Для .реализации способа синтезирован фотоактивируемый реагент N-(4-азндо-2-нитробе»«зоил)-1,2-днаминогептан. Наличие положительного заряда на первой стадии и его блокирование на второй обеспечивает высокий уровень ковалентного присоединения биотина к ДНК и снижение неспецифической сорбции.

Способ и синтезированный для его реализации реагент позволяют также увеличить расстояние между фотоактивируемой группой и биотином, что повышает чувствительность. Применение биотинированной предлагаемы«» способом ДНК для гибридизации позволяет выявлять до 10 r гомологич«4 ной ДНК, причем негомологнчная ДНК

7 в количестве 10 r не выявляется.

1443404

Иэобре1 енеЕе относится к молеку

Айриой .биологии ц..ге11етике и может быть дспользовано в других областях. биологе111 и и медещине для нерадно- актпвного мече111111 нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является увеличение 1еувствительности индикации меченных биотином ДНК при дот.-гибри, де1заевш. 10

Б способе, включающем добавление

N раствору нуклеиновой кислоты фотоактеЕвируеиого peai ента с последующим облучением раствора светом, в качестве фотоактивируемого реагента исполь" зуюг бифункциональное соединение,содержащее фотоактнвируемую группу и гЕоложительно 3аряженную первичную а:п1ногруппу, соединен1н.1е на несущей заряда полимерной цепо Еко"t, и после облучения светом обрабатьпзают полученное соединение бнфу11кцнональ11ьпч . реагентом,. содержащим актив11рованиьп1 сложные1 эфир и биотин, которые соединены полимерной. цепочкой. 25

Ф12тоакте1вируемьей реагент дпя реализ ации способа — И- (4- аэ пдо= 2- t t Et T робснзоил)-1,7-днамЕЛ1огеггглн форt tV.tt1 t

3 . А7

NQ

Пример 1. 11о.1учен11е фоеоактив11р ";сщего реагента. 70 1.111оль .

2-нитро-4-аминобензойноп кислоты суспендируют в 120 мл воцы и по каплям прибавляют 407.-ный растзор едкого калил до полного растворения кислот ы, В полученный 1211ствО12 1311осят

60 ммоль нитрита натрия и охлаждают о до О С. Этот раствор Hg каплям при энергетичном перемешивании добавляют о к охлажденной до -2 С смеси 30 мл концентрированной соля11ое1 к11слаты и

150 мл воды. Смесь оставля1от на 30 мин при О С и затеи при перемещиваяии добавля1от 60 ммоль азида натрия растворенного в 10 мл во1ы. Далее все операции с аэидами проводят

B затемнеш1ой комнате. Лосле 30 мин реакции прн комнатной температуре осадок отделяют, Перекристаллиэонываеот из воды. Выход очищеш1ой 4-аэидо-Z-Etèòðîáåttçîttíîé кислоты состав55 ляет 65Х. 20 ммоль 4-аэ11до-2-нитробензойной кислоты растворя1от в 25 мл диоксана, прибавляют по 20 ммоль Б-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь вьдер" . жиаают.20 ч при 20 С и сильном встряхнвапии. Выпавший осадок отфильтро" вывают и промывают диоксаном. Фильтрат упаривают при пониженном давлении. Полученный Б-оксисукцинимидный эфир 4-азндо-2-нитробензойной кислоты используют в дальнейшем беэ предварительной очистки.

К 2 ммоль 1,7-диаминогептана в

3 мл диокеана добавляют по каплям рас вор 1 ммоль И"-оксисукцинимидного эфира f-àçêäî-2-нитробензойной кислоты в 3 мл диоксана, смесь выдерживают при 20 С и сильном перемешно ванин. -Выпавший осадок отделяеот центрнфугированием, промывают дважды диоксаном .и,все фракции супернатанта объединяют. Диокс."новы- ; р"=твор разбавляют и 5 раз .Еодкислен11ой одой, появлшощийся 1 еболь11 11 о-.едок убирают центр.фуглров l iifP . t Дополнительную очистку проводят с помощь1о тонкослойпой хроматографии в системе хлороформ — этаиол {8:2) ° Продукт двигается одной УФ-гоглощающей .зоной

4 и не содержит примесей 4-азкдо-2-йитробенэойной 1:ислот.,1 нли ее -эфира.

Нал11чие; эидпой группь1 подтверждается поя=ленисм в 1 К-спектре харак-.ерн "Й азидной полосы 2 1 40 ct t c

Е.ес слышим плечом при 2120 см .Спектр

1! поглощения:,,", 260, 370 нм. При облучении светом раствора набл1одается свойственное аэидам падение поглощения в УФ- части спектра. Наличие первичной аминогруппы подтверждено нипгидриновой реакцией и реакцией с

N-оксисукциннмидным эфиром биотинЕел— Е-аминокагроновой кислоты, в результате которой получается один УФ-поглошающий продукт, по подвижности отличный от исходного.

П р и и е р 2. Реализация способа.

Реакцию фотолиза фотоактнвируемого реагента проводят в О, 1 м1.1 ЗДТА в присутствии ДНК в стеклянном капилляре. Облучают вид1яеым светом с длиной волны 340-380 нм. Посче экстракции избытка реа1.ента втор-бутанолом добавляют 10-кратный избыток (по отн0шеннЕо к ocнсван1.111м ДНК) И-.оксисукцинииндного эфира биотинил-Г-аминокапроновой ке1с 1оты. Смесь вылерж11ваГ ют 1 ч при 20 С, дважды экстрагируют

1443404

Формула изобретения

Составитель А.Спундэ

Редактор Л.Волкова Техред g,дидык Корректор Э.Лончакова

Заказ 3329 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4 5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 втор-бутанолом и ДНК осаждают 703пым этанолом.

Биотинированную ДНК иииобилиэуют на нитроцеллюлозных фильтрах нагреваиием при 80 С в течение 2 ч . Дотгибридизацию проводят. при 39 С в среде, содержащей 507. фориамида и

0,4-0,75 М NaC1 в течение 3-15 ч.

После обработки авидином и биотинированной щелочной фосфатаэой определяемые количества ЦНК сбставляют значения порядка 10 -10 r, При применении данного способа и синтезированного для его реализации вещества достигнута чувствительность, примерно на два порядка более высокая по сравнению с прототипом. Положительный эффект связан с увеличением расстояния между фотоактивной группой и биотином.

Способ биотинирования нуклеиновых кислот, .включающий добавление к. раотвору нуклеиновой кислоты фот " актияируемого реагента с последующим облучением раствора светом, о т л ич а ю шийся тем, что, с далью

10 повышения чувствительности индикаций меченных биотином ДНК при дот;-гибридизации, в качестве фотоактнвнруемо- . го реагента используют N-(4-аэидо-2-иитробенэонл)-1,7-диаииногептан

15 с последующей обработкой полученного после облучения светом соединения.

N-окснсукциннмидным эфнрои биотиний"Е-аминокапроновой кислоты в количестве достаточной для блокирования

i0 всех аминогрупн.