Способ получения @ -галактозидазы и штамм бактерий еsснеriснiа coli-продуцент @ -галактозидазы

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения об-галактозидазы генноинжеиерньи путем . Цепью изобретения является повышение степени чистоты фермента. Получение oi-галактозидазы, свободной от активности инвертазы, .обеспечивается в результате клонирования фрагмента ДНК, кодирующего об-галактозидазу в вектор pBR 322 с последующим отбором нужных клонов на питательной среде, содержащей рафинозу, и культированием штаммов бактерий-продуцентов конечного продукта. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (и) (д) 4 С 12 0 15/00, 9/38

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ l Н ПАТЕНТУ

:В (21) 3448724/28-13 (22) 04.06.82 (31) P 3122216.1 (32) 04.06.81 (33) DE (46) 15.1 0.88. Бюл. )1 38 (71) Берингер Маннхайм, 6X (DE) (72) Ральф Маттес и Клаус Бокамп:DE) (53) 575.224.2:574.2(048)(088.8) (56) Патент США У 3562113, кл.195-66, 1971. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ о -ГАЛАКТОЗИДА Ы И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI—

ПРОДУЦЕНТ Ы -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

57) Изобретение относится к области иотехнологии и касается получения р6-галактозидазы генноинженерньы путем. Целью изобретения является повышение степени чистоты фермента.

Получение са-галактозидазы, свободной от активности инвертазы, .обеспечивается в результате клонирования фрагмента ДНК, кодирующего о -галактозидазу в вектор pBR 322 с последующим отбором нужных клонов на питательной среде, содержащей рафинозу, и культированием штаммов бактерий-продуцентов конечного продук- та. 1 з п. ф лы, 1 табл.

1431681

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения ot -галактозидазы генноинженерным путем.

Целью изобретения является повы5 шение степени чистоты фермента.

Получение oL-галактозидазы, свободной от активности инвертазы, обеспечивается в результате клонирования фрагмента ДНК, кодирующего оС-галактозидазу. в вектор pBR 322, с последующим отбором нужных клонов иа питательной среде, содержащей рафинозу, и культивированием штаммов бактерий — продуцентов конечного про- 15 дукта.

Пример 1..Из штамма Escherichia coli BMTV 2743, ВБМ 2092, несущего DNA,,ñîäåðæàùóþ ген о -галактозидазы, получают новый штамм с более высокой продуктивностью в отношении М;галактозидазы.

Штамм Escherichia coli BMTV 2743, (tnr leu, 1Ы, lac Y, tou А, raf+, pets-лизоген), полученный из Е.со1з. 25

К-12, BMTV 2744, DSM 2093, в течение 4 ч культивируют при 30 С и встряхивании в литре питательной среды, содержащей l триптона, О, 5,;., дрожжевого экстракта, 0,2 глюкозы 30 и 0,5 хлористого натрия, и при рН .7,8, причем при достижении оптической плотности 0,5 0D

Для клонирования фрагмента Pl raf

DNA применяют DNA плазмидный вектор

pBR 322, который в качестве маркерных генов содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину.

Штамм Escherichia coli, содержащий пл змиду рВВ 322, культивируют . o при встряхивании при 37 С в 1л питательного бульона до конца экспоненциальной фазы роста. Затем после добавления 150 мг/мл хлорамфеникола встряхивание продолжают в течение

15 ч при указанной температуре. При этом плазмида накапливалась преимущественно в бактериях. После этого получают бактериальные клетки,. осуществляют лизирование с лизоцимом и неионным детергентом. Лизат в течение 30 мин центрифугируют при нагрузке 48000 r с целью получения прозрачной жидкости. Из этой жидкости с помощью двукратного центрифугирования при равновесном градиенте плотности при применении хлористого цезия и бромистого этидия, последующего экстрагирования фенолом и диализа по отношению к буферному раствору (10 мМ трис-НС1, рН 8,0) получают

420 мкг плазмидной DNA.

По 10 мкг Pl raf DNA и векторной

DNA обрабатывают пои 37 С в течение

1 ч эндонуклеазой Sal I для того, чтобы полностью расщепить молекулы

DNA, а затем в течение 5 мин произо водят нагревание до 65 С.

После этого Р1 raf DNA фракционируют с помощью электрофореза на

0,7%-ном агароъом геле. Фрагмент с относительным молекулярным весом четыре мегадальтон отделяют и после экстрагирования фенолом и диализа в буферном растворе (10 мМ трис-НСЬ рН

8,0) получают в растворе.

Раствор полученного указанным способом фрагмента Pl raf DNA смешивают с раствором расщепленного pBR 322 переносчика DNA и после добавления

dATP. дитиоэритрита и хлористого маго ния в течение 24 ч при 4 С подвергают воздействию DNA-лигазы фага Т4.

Обычный шламм Е. cali (BMTV 2744, DSM 2093) при встряхивании культивируют в 50 мл питательного бульона о при 37 С до конца экспоненциальной фазы роста. Клетки отделяют и суспендируют на бане со льдом в 50 мМ растворе хлористого кальция.

Приготовленную суспензию смешивают с раствором рекомбинантной DNA, смесь в течение 20 мин выдерживают на бане со льдом, а затем нагревают о в течение 3 мин до 37 С. Клетки пересевают в питательный бульон и в течение 45 мин производят встряхивание о при 37 С, в результате чего полностью происходит реакция трансформации. Клетки отделяют, промывают и снова суспендируют. Небольшую часть суспензии клеток наносят на покрытую агаром пластину, причем агар содер81

40

Активность < -галактозидазы, У)мг"

Штамм, N-

BMTV 2742 (D$M ) 2091 ) BMTV 2743

55 (В$М 2092) 10

0,4 з I43I6 жит на литр !0,5 г К НР04, 4,5 г

КН РО4, 1 r (ИН4) $0,., 0,5 г цитрата натрия 2 Н О, О, 1 г сернокислого магния «7 Н О, 1 мг тиамина, 2г рафинозы, 25 г ампициллина и 15- r arapa (рН 7,2), Пластину выдерживают при о

37 С. После выдерживания в течение

2 сут, на пластине появились многочисленные колонии. Все колонии собирают, 10 очищают и отделяют.

Каждая из полученных указанным способом колоний обладает способностью использовать рафинозу в качестве единственного источника углерода и одно временно была устойчива к действию ампициллина. Таким образом, они обладают иными свойствами по сравнению со штаммом, который был применен в качестве организма-хозяина. 20

Из полученных колоний в каждом случае выделяют плазмидную DNA.

Отбирают плазмиду из колоний, которые после обработки ферментом

Есо R I или Hind III дают меньший второй фрагмент, чем плазмиды других колоний. Бактерии, которые несут эту плазмиду, могут использовать рафинозу в качестве единственного источника углерода и про- З0 изводить все ферменты-оперона.

По 10 мкг DNA рВТ 100 иэ BMTV

2741 (?)ЯМ 2090) в течение 1 ч об рабатывают при 27 С либо эндонуклеазой Hind III или эндонуклеазой

Есо R I с целью расщепления DNAмолекул. Затем в течение 5 мин о производят нагревание при 65 С.

Раствор обрабатывают таким образом плазмицной DNA, подвергают обработке Т4-лигазой.

Непосредственно после этого компоненты клетки штамма Е.coli обрабатывают .раствором ренатурированной

DNA. Небольшую часть обработанных указанным способом клеток наносят на пластины "Мас Concey Paffinose" (Difco Labaratories Detroit) с 25 мкг/мл ампициллина. На пластинах в случае трансформации плазмидной

DNA обрабатывают предварительно с применением Ндпй III, после выдержки в течение 24 ч при 27 С образуо ется приблизительно 20 колоний, а на пластинах в случае трансформации

DgA, предварительно обработанной

Есо В Х, выявляют приблизительно 30 колоний; Соотношение красных колоний к белым составляет в первом случае 1:4, во втором случае — 1:3 °

Красные колонии во всех случаях расщепляют рафинозу, т.е, в них все еще содержится целый raf-оперон. Белые клетки не обладают способностью расщеплять рафинозу. Однако, они все продуцируют фермент сС-галaктозидaзу, как показал тест в свободном от клеток экстракте с и-нитрофенил-!;галактозидом (Ы-ПНФГ) в качестве цветного субстрата, в том случае, когда клетки без предварительного добавления рафинозы культивируют в питательном бульо оне при 37 С до образования станционарной фазы. Поэтому такие клетки обладают другими сввйствами по сравнению с организмом-хозяином или клетками BMTV 2741 (DSM 2090), которые трансформированы с применением рВТ 100. .Плазмиду, которую после предшествующей Hind III обработки рВТ 100 получают на "Mac Concey пластинах в виI де белых колоний, называют рВТ 101, а плазмиду полученную в результате предшествующей реакции с Eco R I, называют рВТ !02. Штамм E.coli с рВТ 102 называют BMTV 2742 (ПЯМ 2091).

В табл. 1 представлены экспериментальные результаты испытаний свободного от содержания клеток экстракта на содержание о!.-галактозидазы с о

g!.-ПМФГ после культивирования при 25 С

ВМ."ГЧ 2742. Клетки инкубируют в 10 мл питательного бульона в колбе емкостью 10% мл, после чего в течение 15 ч о производят встряхивание при 30 С,Контрольный опыт осущеставляют при культивировании исходного штамма BTMV

2743 в таких же условиях, но при добавлении к среде 0,2% рафинозы.

Как видно из таб. 1, экстракт штамма BNTV 2742 в сравнении с H4TV 2743 отличается значительно более высоким содержанием галактозидаэы. мг растворенного белка в сырьевом экстракте изобретения

Ф о р м у л а -.Ф

Составитель Н, Рыбальский

Техред А.Кравчук

Редактор А. Долинич

Корректор С. Черни

Заказ 5358/59 Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

)43)6

При соблюдении этих условий проведения опыта в известном штамме Е.со11

BMTV 2744 обнаруживалась активность а 0,001 U/ìã, Штамм Е.coli DSM 2091 обладает всеми свойствами, типичными для штаммов

Е. coli.

Морфология: палочки, отдельные или парные. )o

Развитие: аэробное нли факультативно анаэробное, оптимальйо при

37 С.

Другие характеристики: грам-отрицательны,не спорообразующая бактерия, 15 хемооргамотроф каталазо-позитивный оксидазо-негативный.

Он содержит плазмиду рВТ 102, ус- тойчив к ампициллину в концентрации 50 мкг/мл и внутриклекточно про2О дуцирует ь6-галактоэидазу, которая не нуждается s присутствии дополнительных агентов, но не производит инвертазу. В остальном он не отличается от штамма Е. coli К-12 и может куль25 тивироваться при 37 С на стандартной среде, наиболее целесообразно при аэрации.

1. Способ полученияо -галактозидазы путем культивирования микроорганизмов на питательной среде, содер,жащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого про81 6 дукта, отличающийся тем, что, с целью повышения степени чисто-: ты фермента за счет уменьшения содержания инвертазы, из штамма Е.coli

DSM 2092 выделяют ДНК, содержащую ген о -галактозидазы, расщепляют ДНК эндонуклеазой Яа1 Т, выделяют фракции ДНК, несущие ген oL-ràëàêòîçèäàзы размером около четырехмегадальтон, после сшивают полученный фрагмент с расщепленным рестриктазой

Ба1 I вектором pBR 322, содержащим ген устойчивости к ампициллину, в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 при добавлении АТФ, дитиоэтрита и хлористого магния, полученную рекомбинантную ДНК инкубируют с клетками Е.cori, трансформированные клетки культивируют на питательной среде, содержащей

2 — 10 г/л рафинозы, образовавшиеся устойчивые к ампициллину колонии отделяют и лизируют, из лизата выде" ляют плазмидную ДНК 6,9-12,4 мегадальтон, которую ращепляют .рестрикционной эндонуклеазой Hidn III и обрабатывают ДНК-лгиазой, полученную ренатурированную плазмиду рВТ 102 суспендируют с клетками Е.coli,трансформанты вновь культивируют на питательной среде, содержащей 2-10 г/л ! рафинозу и ампициллин, отбирают колонии Е. coli, использующие рафинозу, и получают целевой продукт культивированием этих клонов микроорганизмов .

2 Штамм бактерий Escherichia coli

DSM 2091 — продуцент <-галактозидазы.