Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к интерлейкину-2 человека
Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Цель изобретения - упрощение способа получения штамма - продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину-2 (IL2) человека, увеличение уровня биосинтеза. Штамм получают от слияния миеломных клеток X63 AG 8 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом 1L2, который получают из культуральной жидкости клеточной линии JURKAT. Иммунизацию мышей осуществляют однократным введением очищенного 1L2 в селезенку, слияние клеток проводят полиэтиленгликолем в присутствии 5-15% диметилсульфоксида. Затем отбирают положительные клоны по связыванию с рекомбинантной и гликозилированной формами 1L2. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 127Д. Концентрация МА в культуральной жидкости 75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа связывания МА с интерлейкином-2 составляет 5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">8</SP> М<SP POS="POST">-</SP>1. Получаемые МА являются иммуноглобулинами класса G 1 и могут быть использованы для тестирования 1L2 в биоллогических жидкостях и бактериальных лизатах, а также для создания иммуноферментных и радиоиммунных диагностикумов.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН (19) (111
8 А1 (51)4 С 12 И 5 00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ П(НТ СССР (21) 4297476/31-13 (22) 14.08.87 (46) 15..04,89. Бюл.У ) 4 (71) Институт биоорганической химии им. M.М.Шемякина (72) 1(I.А.Овчинников, В.F..Ëóíåâ, В.А.Несмеянов, Н.В.Казенных и С.В.Беляев (53) 578.085.23(088.8) (56) Robb В.Х. in ó, "Methods
Enzymology", 116,493(1985). (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ М(1$ МУНС(ПЛБ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЪНЫХ АНТИТЕЛ К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-2
ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Цель изобретения — упрощение способа получения штамма - продуцента моноклональных антител (МА) к интерлей, кину-2 ( Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Цель изобретения — упрощение способа получения штамма — продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину 2/lL, 2/ человека, увеличение уровня биосинтеза МА, . Штамм получают. следующим образом. Мьппь линии BALB/Ñ иммунизируют препаратом П 2. Интерлейкин 2 получают из культуральной среды от клеток линии Jurkat 8 653 со спленоцнтамн .яппи, иммунизированной препаратом Г 2, который получают из культуральной жидкости клеточной линии (иг1:а ;.. Иммунизацию мьппей осуществляют однократным введением очищенного lL 2 в селезенку, слияние клеток проводят полиэтиленгликолем в присутствии 5-15% диметилсульфоксида. Затем отбирают ïoëâжительные клоны по связыванию с рекомбинантной и гликозилированной формами ТЬ 2. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) У 127Д. Концентрация МА в культуральной жидкости 75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа связывания МА с интерлейкином-2 составляет 5 «10 М . Получаемые МА являются иммуноглобулинами класса G 1 и могут быть использованы для тестирования IL 2 в биологических жидкостях и бактерпальных лизатах, а также для создания иммуноферментных и радиоиммунных диагностикумов. 2 (2 "10 кл./мл) . стимулированных конканавалином А (20 мкг/мл) и 4р-форбол-12 8 --миристат-13 -ацетатом (10 кг/мл) в среде ВРМХ 1640 с 300 мкг/мл L-глютамина. Культуральную среду (3 л), содержащую П 2, собирают через 20 ч после начала стимуляции, освобождают от клеток центрифугированием (400xg), концентрируют до объема 300 мл в ячейке для ультрафильтрации и хранят при -20 С до использования. Содержание о IL 2 в концентрированном супернатанз 14 те составляет 0,3 мкг/мл при общей концентрации белка 0,5 мг/мл. К концентрированному супернатанту добавляют 168 г сульфата аммония (80 насьпцения) и выдерживают в течение одного часа. Осадок отделяют центрифугированием (10000xg 30 мин), растворяют в 5 мл 0,01 М натрийфосфатного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15 M NaCl и O,l полиэтиленгликоля 6000 (ФСБП), и проводят диализ против того же буфера (18 ч). Отдиализованный образец наносят на колонку с ультрогелем АсА 54 (2,5"90 см) и элюируют ФСБП. Фракции, имеющие IL 2-активность, выходят с колонки как симметричный пик, соответствующий белку с молекулярной массой 15000 дальтон. Активные фракции объединяют, наносят на 10-мл колонку с голубой сефарозой CL-6В и колонку промывают ФСБП. Элюирование проводят градиентом NaCl от 0,15 до 1 M IL 2 выходит с колоики в интервале 0,3 М до 0,5 М NaCl. Активные фракции объединяют, концентрируют и подвергают лиофилит зации. Лиофилизованный препарат IL 2 при хранении в холодильнике сохраняет активность в течение двух месяцев. Выход IL 2 составляет 55 . (50 мкг), удельная активность— 8,7«106 единиц/мг белка. Все операции при выделении IL 2 проводят при 4 0С. Биологическую активность ХЬ 2 определяют с помощью IL 2-зависимой линии цитотоксических Т-лимфоцитов мыши. Уровень пролиферации оценивают путем окрашивания клеток 3-(4,5диметиптиаэол-2-ил)-2,5-дифенилтетра золнйбромидом. Количественную оценку осуществляют сравнением тестируемых образцов П 2 с международным стандартом. IL 2 (25 мкг) в физиологическом растворе вводят в селезенку анестизированной мьппи. Через четыре дня после иммунизации мьппь забивают, . Селезенку забирают асептически, переносят в чашку Петри и: перфуэируют средой, для чего в селезенку вводят в несколько точек иглы и нагнетают под напором среду. Клеточную суспенэию переносят в пробирку и позволяют неразбившимся комочкам клеток осесть в течение 2-3 мйн. Клеточную суспензию декантируют в другую про72498 4 бирку и центрифугируют (200xg, 10 мин) при комнатной температуре, Затем 30 10 селезеночных клеток мы6 5 ши и б «106 миеломных клеток Х63 Ag 8 653 смешивают в пробирке и промывают средой RPMI-1640. Надосадочную жидкость осторожно удаляют и при помешивании к клеточному осадку медленно, по каплям, в течение 30 с добавляют 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000 с 10 диметилсульфоксида в среде RPMI-.1640. Через одну минуту для разбавления полиэтиленгликоля по каплям приливают 10 мл-RPMI 1640. Клетки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют (200 xg 10 мин),.Надосадоч20 ную жидкость декантируют, к осадку добавляют 40 мл RPMI 1640, содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), суспенэируют клетки пипетированием и клеточную суспен25 зию распределяют в четыре 96-луночные плашки, в которые за день до слияния высаживают мьппиные перитонеальные клетки (5 «1О клеток на лун- ку). На следующий день в лунки план3п ки вносяп" по 100 мкл среды, содержащей 2: 1 О M гипоксантина, 8 10 и М аминоптерина и 3,2 10 М тимидина. Клоны гибридных клеток становятся заметными через 7-10 дней. Тестиро35 ванне клонов проводят, когда клетки заполняют лунку иа 20 .. Положительные культуры клонируют методом лими- тирующих разведений при плотности 0,1-1 клетка на лунку, 40 Полученный штамм обозначают ЛНКБ-1, он депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/ В 127D и характеризуются следующими признаками. Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования. Среда RPMI-1640, 300 мг/мл L-глютамина, 10% 3ТС, 5 10" М меркаптоэтанола, температура 37 С. При суспензионном культивировании клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаются свободно. При посевной плотности 1 10 +- 5 "10 кл./мл через 3-5 дней плотность достигает 3-10% ° 10 кл./мл. Кратность.рассева 510 pas. 72498 5 14 Культивирование в организме животных. Гибридные клетки прививают и выращивают в виде асцита в перитонеальной полости мышей линии HALB/C, 3а 7 дней до введения клеток мышам вводят по 0,5 мл пристана. Осцит образуется через 10-14 дней после введения 2-5 млн. клеток. Продуктивность штамма. Концентрация специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкости 5-10 мг/мл. Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует иммуноглобулин G субкласса I. В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии Jurkat и рекомбинантного IL 2. Стабильность продуцирования ан-тител сохраняется на протяжении 25 пассажей в культуре. Криоконсервирование. Среда для замораживания — 90 . ЗТС, 10 ДИСО. Плотность клеток 1-5 " «10Ь кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке выдерживают при о -70 С в течение 1 дня и переносят в дюары с жидким азотом. Режим отогрева — водяная баня при 37 С. Жизнео способность клеток после криоконсервирования 60 по окрашиванию с трипановым синим.. Контаминация. Контаминации отсутствуют. Пример l. Иммуноферментный анализ моноклональных антител ЛНКБ-1. Образцы, содержащие антитела (супернатанты клеточных культур или асцитная жидкость), тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа по связыванию с препаратами IL 2 из клеточной линии Jurkat и ре-. комбинантного IL 2. В лунки 96-луночной плашки вносят препарат IL 2 (50 нг на лунку) в 0,05 M бикарбонатном буфере рН 9,6 и оставляют на 18 ч при 4 С, Плашку отмывают 0,1 ным раствором твина-20 в 0,01 М натрий фосфатном буфере, содержащем 0,15 M NaC1 (ФСБТ), рН 7,2 и инкубируют с 200 мкл 1 -ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 37 С. Плашку снова отмь»вают ФСБТ и вносят в лунку по 100 мкл препарата, содер5 55 жащего антитела. После инкубации о в течение одного часа при 37 С плашки отмывают ФСБТ и обрабатываютраствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (100 мкл на лунку, разведение 1:1000, 1 ч 37 C). Плашку еще раз отмывают и вносят 100 мкл раствора орто-фенилендиамина (1 мг/мл) в 1Х-ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05 Н 0 . Реакцию останавливают через 15 мин добавлением 100 мкл на лунку раствора 2М Н БО . Отрицательным контролем служат лунки плап»ки, не содержащие IL 2, а также лунки, в которые вместо антител к IL 2 вносят нормальный иммуноглобулин мьш»и. Пример 2. Получение и очистка моноклональных антител. а) Получение и очистка ЛНКБ-1 антител иэ культуральной и асцитной жидкости. Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрасах в среде RPMI 1640, содержащей 10 ЗТС, 300 мг/л L-глутамина и 5 "10 M 2меркаптоэтанола. При посевной плотности 5 «10 кл./мл через пять дней плотность достигает 1 «10 кл./мл. Культуральную жидкость с максимальной продукцией иммуноглобулинов (75 мкг/мл) получают от клеток в стационарной фазе роста (седьмой день). Очистку иммуноглобулинов проводят на протеин А-сефароэе: культуральную жидкость (200 мл), рН которой доводят до 8,5, наносят на колонку объемом 5 мл. Колонку промывают 0 01 M натрийфосфатным буфером, содержащим 0,15 M хлористого натрия (ФСБ), рН 9,5, и элюируют специфически адсорбировавшийся иммуноглобулин 0,1 M цитратом натрия с 0,15 M NaC1 рН 3,5. Злюат сразу нейтрализуют 1 M раствором трис-HCl рН 8,1. Раствор иммуноглобулинов концентрируют до 3 мг/мл и диализуют против ФСБ, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10 ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Выход 70 мг на 1 л культуральной жидкости, При получении иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитонеальной полости мышей линии ВАЬВ/с, 3а 7 дней до инъекции клеток мышам 1472498 вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Асцитную жидкость забирают через 14 дней после введения 4 10 клеток на мышь. С одной мыши получают 6 мл асцитной жидкости. После отделения клеток центрифугированием (400xg) асцитную жидкость разбавляют до концентрации белка 10мг/мл и проводят высаливание 40Х.-ным сульфатом аммония (2,4 г сульфата аммония на 10 мл разбавленного асццта). Осадок отделяют центрифугированием (10000хд, 30.мин), растворяют в ФСБ буфере, рН 8,5, и диалиэуют против этого же буфера. Дальнейшую очистку проводят на протеин А-сефарозе по описанной схеме. Выход гомогенного по данным электрофореза в полиакриламидном геле иммуноглобулина составляет 5 мг из 1 мл асцитной жидкости. б) Определение концентрации ЛНКБ-1 антител в культуральной и асцитной жидкостях. В лунки 96-луночной плашки вносят по 250 нг кроличьих антител к IgG мыши.в 0,05 И бикарбонатном буфере, рН 9,6 и инкубируют 18 ч при 4 С; Лунки плашки отмывают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1Х-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (1 ч, 37 С), После отмывки лунок ФСБТ по плашке раститровывают образцы (100 мкл), содержащие моноклональные антитела, и инкубируют в течение. 1 ч при 37 C затем лунки плашки отмывают ФСБТ и вносят 100 мкл кроличьих антител к IgG мыши, меченных пероксидазой хрена. Далее ИФА проводят как описано в примере 1. В качестве стандарта используют нормальные мьппиные иммуноглобулины. Концентрация моноклональных антител, в культуральной жидкости составляет 75 мкг/мл. Концентрация иммуноглобулина в асцитной жидкости составляет 8 мг/мл. в) Определение константы связывания MA ЛНКБ-1 с IL 2. Константу связывания определяют с помощью ИФА по уравнению К = 1/(4 MAB — 2 MAB), где MAB - кон50 Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных пауз musculus BCKK(II) N- 127Д, используемый для получения моноклональных антител к интерлейкину 2 человека. центрация антител, соответствующая 50 связыванию от максимального; MAB — концентрация антител, соответствующая 507. связыванию от макси" 5 мального в случае нанесения на плашку вдвое меньшего количества антигена. Количество IL 2 нанесенного :на плашку, соответствует 100 и 50 нг/лунку. Константа связывания составляет 5 «10 M ", Пример 3. Использование моноклональных антител ЛНКБ-1 дюжая определения IL 2. Культуральный супернатант (1,5л), полученный в результате стимуляции клеток линии Jurkat, высаливают и наносят на колонку с ультрогелем АсА 54 (пример 1). После проведения гельфильтрации каждую фракцию тестируют в биологическом тесте (в разведении 1:10) и в твердофаэном иммуноферментном анализе (100 мкл, иэ каждой фракции вносят в плашку, далее как в примере 1). Иммуноферментное и биологическое тестирование дают одинаковые профили элюирования XL 2. Такую же корреляцию биологическим тестом и ИФА получают после хрома30„ тографии.препарата IL 2 на колонке с голубой сефарозой GL-6B. Таким образом, использование штамма гибридных клеток ЛНКБ-1 поз- i воляет моноклональные антитела к IL 2 человека, используя для этого 35 более простую и экономичную технологию; кроме того, указанный штаммпродуцент является более продуктивным, чем известные: так уровень био40 синтеза моноклональных антител составляет 75 мкг/мл, что на ЗЗЕ больше, чем получаемый в известном, продуцируемые этим штаммом моноклональные антитела имеют константу, связывания с интерлейкином 2 5 «10 М 
