Способ определения лимфокинов

 

Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности определения гепатотропного лимфокина. Цель достигается путем внесения исследуемого раствора на иммобилизированные на твердом носителе мембраны клеток печени в присутствии раствора радиоактивно-меченого стандартного гепатотропного лимфокина с последующим выявлением лимфокина по конкурентному ингибированию связывания на носителе меченого лимфокина. Стандартный радиомеченный гепатотропный лимфокин получают путем инкубации бластных лимфоцитов селезенки, полученных через 4-24 часа после индукции регенерации печени, в культуральной среде с радиоактивно-меченными аминокислотами, с последующим высаливанием из культуральной жидкости при 60-80% насыщения сернокислым аммонием.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

16 А) (19) (11) (51) 4 С 01 N 33/534

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ аминокислот аланина, гистидина, триптофана, метионина, лейцина. Через

6 ч инкубации клетки осаждают центрифугированием и из надосадка высаливают меченый фактор серно-кислым аммонием при 607 насыщения После 5кратной отмывки центрифугированием насьпценным раствором серно-кислого аммония осадок растворяют в физиологическом растворе, забуференном трисНС1. Выделено 1,8 ° 10 CPM-фактора (счет в импульсах в минуту на сцинтилляционном счетчике "Рак-бэта").

Мембраны печени получают ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, забирая материал на границе растворов 20/427., с последуГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4211436/28-14 (22) 12.02.87 (46) 23.05.89. Бюл. ¹ 19 (75) В.И. Донцов (53) 615.475(088.8) (56) Последние достижения в клинической иммунологии. /Под ред, Томпсона.

M.: 1983, с. 332-373. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИ11ФОКИНОВ (57) Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения является повышение точности определения гепатотропного лимфокина. Цель достигается путем внесения исследуемого раствора на иммобилизированные на тверИзобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунологии.

Цель изобретения — повышение точности определения гепатотропного лимфокина.

Пример 1. От 15 мьппей BAL

В/с, самок, массой тела 18-20 r, которым вводят за 24 ч до исследования перорально 0,15 мл 77 СС14 в подсолнечном масле для индукции репарационной регенерации печени, получают бластные клетки селезенки, центрифугируя взвесь клеток селезенки в растворе фикол-верографина плотностью

1,070, из расчета 5 10 клеток селе7 зенки на 2 мл раствора, при 250 я в течение 45 мин при 4 С. Клетки отмывают дважды центрифугированием в сре де 199, разбавляя надосадок, содержадом носителе мембраны клеток печени в присутствии раствора радиоактивномеченого стандартного гепатотропного лимфокина с последующим выявлениемлимфокина по конкурентному ингибированию связывания на носителе меченого лимфокина. Стандартный радиоактивно-меченый гепатотропный лимфокин получают путем инкубации бластных лимфоцитов селезенки, полученных через 4-24 ч после индукции регенерации печени, в культуральной среде с радиоактивно-мечеными аминокислотами, с последующим высаливанием из культуральной жидкости при

60-807 насьпцения серно-кислым аммонием. щий бластные клетки, в соотношении 1:3, и суспендируют в среде 199 в объеме 10 С-меченых

1481689 ющим охлаждением мембран при 13000g

15 мин. Связывание мембран с СИВгактивированной сефарозой проводят IIo методике, рекомендуемой фирмой, из расчета 100 мкг белка мембран на 5.мл

5 набухшей сефарозы в течение 16 ч при

4 С.

Для связывания радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина с фиксированными на сефарозе мембранами печени к 0,1 мл суспензии сефарозы с иммобилизированными мембранами добавляют 0 05 мл С-меченого фактора

44 активностью 15 000 СРМ ° Через 30 мин инкубации при комнатной температуре проводят отмывку несвяэавшегося фактора дважды по 5 мл холодного физиологического раствора, центрифугируя пробы при 600g 2 мин и декантируя 20 надосадок. Пробы ставят в дубликатах.

Просчет радиоактивности в сцинтилляторе Брея показал связывание

3040+154 CPM в пробе.

Пример 2. Тест-систему по примеру 1"используют для выявления немеченого гепатотропного лимфокина в исследуемой сыворотке мышей BAL

В/с, у которых индуцируют репарационную регенерацию печени введением перорально четыреххлористого углерода в количестве О, l5 мл 7 -ного раствора в масле. Используют пул сывороток от пяти опытных мышей в группах на З-й, 4-й, 5-й, 7-й и 14-й дни индукции регенерации от пяти интактных животных.

Сыворотку в количестве 0,025 мл вносят в тест-систему перед внесением радиоактивно-меченого стандартного лимфокина. B присутствии сыворотки от интактных мышей связывание радиоактивно-меченого гепатотропного лимфокина составляет 2112+45 CPM или

30,5Х ингибирование связывания стандартного радиоактивно-мечвного лим45 фокина в отсутствии сыворотки. На 3-й день регенерации ингибирование составляет 50,5Х (1506+122 СРМ связывания), на 4-й день 51,3Х (1481+3 CPM связывания), на 5-й день 50,9Х

50 (1.492+4 CPM связывания). На 7-й и

14-й дни, когда регенерационный процесс у мышей заканчивается, ингибирование связывания не отличается от такового для интактных животных: 34,5 55 и 28,8Х соответственно.

Пример 3. Для получения тест-системы от 15 мышей ВА1. В/с по лучают бластные клетки селезенки через 4 ч после индукции регенерационного процесса по примеру 1. Клетки в тех же условиях инкубируют 1 сут и высаливают С-меченый фактор

«+ серно-кислым аммонием при 80Х насыщения. В качестве специфического сорбента используют мембраны печени, фиксированные на 4В сефарозе по примеру 1.

При постановке реакции связывания

17000 СРМ-фактора в 0,1 мл физиологического раствора инкубируют с мембранами печени в присутствии или без

0,025 мл сыворотки контрольных и опытных мышей при комнатной температуре, отмывая и просчитывая результаты.

В контроле связывается 1899+129

CPM-фактора. В присутствии сыворотки интактных мышей связывается 1452+81

CPM меченого фактора, что составляет

11,5Х ингибирования связывания в стандарте. В группе опытных мышей на

3-й день индукции регенерации печени пероральным введением 0,15 мл 7Х-ного четыреххлористого углерода связывание в присутствии сыворотки этих мышей составляет 1078+107 CPM или

38,5Х ингибирования связывания стандарта.

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

1. Способ определения лимфокинов, включающий введением их в тест-систему, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения гепатотропного лимфокина, в качестве тест-системы используют иммобилизованные на твердом носителе мембраны клеток печени, содержащихся в растворе радиоактивно-меченого стандартного гепатотропного лимфокина, а определение в пробе осуществляют по конкурентному ингибированию связывания на носителе радиоактивномеченого лимфокина, 2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве стандартного радиоактивно-меченого гепатотропнсьго лимфокина используют белковую фракцию из культуральной жидкости, полученную путем инкубации культуры лимфоцитов селезенки, выделенных через 4-24 ч после индукции регенерации печени, а радиоактивномечеными аминокислотами и высаливанием при 60-80Х-ном насыщении сернокислым аммонием.