Способ определения витамина в @ в цветочной пыльце

 

Изобретение относится к биохимии и биохимическим методам определения свободного витамина В<SB POS="POST">1</SB> в цветочной пыльце. Цель - ускорение и повышение точности способа. Суспендируют пыльцу в 0,1 н.соляной кислоте, отфильтровывают, к фильтрату добавляют ацетат натрия и трихлоруксусную кислоту, после 10 мин инкубации отделяют супернатат, добавляют к нему железосинеродистый калий и измеряют флуоресценцию. фиг.5.

СООЗ СОВЕТСНИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН дц 4 G 01 N 33/82

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

Il0 ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4157825/28-14 (22) 09.12.86 (46) 30.08.89. Бюл. М 32 (71) Научно-исследовательский инст— тут эпидемиологии, микробиологии и гигиены (72) К.В. Кадзяускене и А.Ю. Мачекас (53) 612.015(088.8) (56) Методы биохимических исследований растений/Под ред. А.И. Ермакова, Л.: Колос, 1972, с ° 99-103.

Изобретение относится к биохимии и биохимическим методам определения свободного витамина В в цветочной пыльце.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Согласно предлагаемому споСобу суспендируют исследуемое вещество путем добавления 0,1 н. соляной кислоты, добавляют 2,5 М ацетата натрия до рН 4,5-5, затем добавляют железосинеродистый калий в щелочной среде до образования тиохрома, проводят количественное определение витамина В путем флуориметрии. При этом после стадии суспендирования суспензию фильтруют, а после добавления ацетата натрия осуществляют осаждение белков путем 8-10-минутной инкубации исследуемого фильтра с трихлоруксусной кислотой (ТХУ), концентрация которой в фильтрате должна составлять 0,51,07, после чего осадок отделяют

„„SU„„1504599 А 1

2. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В.1

В ЦВЕТОЧНОЙ ПЫЛЬЦЕ (57) Изобретение относится к биохимии и биохимическим методам определения свободного витамина В, в цветочной пыльце. Цель — ускорение и повышение точности способа. Суспендируют пыльцу в 0,1 н. соляной кислоте, отфильтровывают, к фильтрату добавляют ацетат натрия и трихлоруксусную кислоту, после 10-мин инкубации отделяют супернатат, добавляют к нему желе/ эосинеродистый калии и измеряют флуоресценцию. 5 фиг. центрифугированием при 2800-4000 g в течение 8-10 мин.

На фиг. 1 показана зависимость

° I количества свободного витамина В от 2 концентрации ТХУ в фильтрате; на фиг ° 2 — зависимость количества свободного витамина В, от времени инкубации образцов цветочной пыльцы на водяной бане до 100 С; на фиг. 3 зависимость количества витамина В, от времени инкубации с ТХУ; на фиг.4 — CO зависимость количества витамина В Cgl от условий центрифугирования; на фиг. 5 — зависимость оптической плот1 ности при % 540 нм от времени центрифугирования.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Навеску 1 г цветоч- аЬ ной пыльцы суспендируют в 20 мл

0,1 н. НС1 и перемешивают при помощи магнитной мешалки в течение 3 мин до образования гомогенной суспензии.

Суспензию фильтруют через стеклянный где А

А, В

В, Ч „ показания флуориметра для исследуемого окисленного раствора; показания флуориметра для ис- 45 следуемого раствора после гашения флуоресценции тихрома с 5 н. НС1; показания флуориметра для стандартного раствора, в котором концентрация витамина

В(, 1 /1 мл; показания флуориметра для стандартного раствора после гашения флуоресценции тиохрома с 5 н. НС1; общая вытяжка цветочной пыльцы после центрифугирования (20 мл);

3 1504599 фильтр У 40. Осадок отбрасывают, а в фильтрат добавляют 2,5 мл 2,5 М раствора ацетата натрия до рН 5,0.

Для осаждения белков в фильтрат объемом 24 мл добавляют 0,6 мл;207-ного раствора ТХУ, концентрация которого в фильтрате должна составлять

0В5Х и инкубируют в течение 8-10 мин при комнатной температуре. Осадок от- 10 деляют путем центрифугирования при факторе разделения (F ), равном

255.102-367.347 (что при данных условиях соответствует 2800-4.000 g или

5.000-6.000 об/мин при расстоянии от оси вращения ротора до частицы 10 см) в течение 8-10 мин. Измеряют объем (Ч ) супернатанта.

Для перевода тиамина в тиохром (флуоресцентную форму) используют 20 окисляющую смесь: 0,047-ный раствор

K>Fe(CN) в 157-ном NaOH. В 5 мл супернатанта (V ) добавляют 3 мл окис1 ляющей смеси, встряхивают в течение

30 с в мерной воронке. Далее прибав- 25 ляют 12 мл изобутилового спирта и опять встряхивают в течение 1 мин.

Реакционную смесь оставляют на 10—

15 мин в темноте для расслоения.Нижний водный слой отбрасывают, а из 30 изобутилового слоя берут 10 мл, туда прибавляют 0,5 мл этилового,спирта и встряхивают до образования прозрачного раствора.

Флуоресценцию раствора,измеряют при помощи флеориметра ЭФ вЂ” ЗМ, используя фильтры для определения витамина

В>. Содержание тиамина определяют по следующей формуле:

40 х = ((A — А,): (B — В,)j (Ч, (Ч„a)), V — вытяжка цветочной пыльцы, в которой осуществляют окисление (5 мл); н — навеска образца цветочной пыльцы, Пример 2. Определение оптимальных доз ТХУ.

Исследовали зависимость количества свободного витамина В от концентрации ТХУ. Данные графика (фиг. 1) показывают, что существует оптимальная концентрация ТХУ в фильтрате (0,5-1,0X), при наличии которой в вытяжке цветочной пыльцы между концентрациями адсорбированного белками и свободного витамина В . уста1 навливается равновесие.

Как показали исследования, полное осаждение белков из фильтрата цветочной пыльцы при помощи ТХУ зависит от продолжительности инкубации (фиг.3). Максимальное количество свободного витамина В(определяют при

I продолжительности инкубации 8-10 мин.

Более длительная инкубация нецелесообразна, а сокращение времени инкубации приводит к неполному осаждению белков из фильтрата.

Пример 3. Определение оптимальных условий центрифугирования.

Экспериментально установлено (фиг.4), что максимальное количество витамина

В определяется в супернатанте при значении центрифугального поля равном 2.800-4,000 x g что соответствует фактору разделения (F ) 255. 102367.347 при радиусе ротора центрифуги 10 см, Оптимальное время центрифугирования 8-10 мин (фиг. 5). Такая продолжительность центрифугирования (как показали измерения оптической плотности супернатанта при длине волны % = 540 нм, которой измеряется рассеивание света частицами) обусловливает прозрачность супернатанта и полное осаждение белков, что является суще твенным для количественного определения витамина В1.

Применение предлагаемого способа определения витамина В по сравнению с прототипом позволяет сократить время определения, так как исключаются такие операции, как нагревание суспензии перед и после добавления

ТХУ, кроме того, отсутствует стадия удаления примесей, повысить точность определения ввиду повышения качества исследуемых растворов (фильтрование

5, 1504599 6 через стеклянный фильтр и центрифугирование) и наименьших потерь вита- ускорения и повышения точности спомина Вт-. соба, суспензию Перед добавлением

5 ацетата натрия фильтруют затем пос1

Ф о р м у л а и з î б р е т е и и я ле обработки ацетатом натрия к фильтСпособ определения витамина В,, рату добавляют трихлоруксусную кислов цветочной пыльце путем ее суспен- ту до концентрации 0,5-1,0Х и смесь дирования в соляной кислоте, добавле- инкубируют 8-10 мин,, затем отделяют ния ацетата натрия, обработки железо- 10 полученный осадок центрифугированием синеродистым калием в щелочной среде при 2800-4000 g в течение 8-10 мин,, с последующим измерением флуоресцен- а супернатант обрабатывают келезоции в сравнении с контролем, о т л и- синеродистым калием.

JHOW. В

1504599

11 t, cue анонц. В, 18,ital

Составитель А. Попов

Редактор Л. Веселовская Техред М,Дидык Корректор Т. Малец

Заказ 5247/46 Тираж 789 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101