Способ определения нарушений специфического т-клеточного иммунитета

 

Изобретение относится к лабораторной иммунодиагностике в медицине и ветеринарии и позволяет дать четырехстепенную классификацию выраженности нарушений клеточного иммунитета на основе дифференцированной оценки уровня антигенраспознающей функции Т-лимфоцитов и сохранности акцепторной функции Т-лимфоцитов в отношении эндогенного и экзогенного трансфер-фактора. Целью изобретения является повышение точности определения нарушения специфического Т-клеточного иммунитета за счет дифференцированной оценки уровня антигенраспознающей и акцепторной функции Т-лимфоцитов. Возможность такой оценки достигается тем, что для каждого антигена готовят по два одинаковых ряда разведений и устанавливают разницу между концентрациями антигена, которые вызывают конгломерацию лейкоцитов в отсутствии и присутствии содержащего трансферфактор лимфоцитарного ультрафильтрата, и при выявлении снижения концентрации антигена в присутствии экзогенного трансфер-фактора более чем в 2 раза определяют недостаточность эндогенного трансфер-фактора, а при выявлении отрицательной реакции конгломерации лейкоцитов определяют более глубокое нарушение - нарушение акцепции трансфер-фактора. При этом в качестве источника эндогенного трансфер-фактора используют ультрафильтраты, приготовленные из смеси лимфоцитов от 50 или более случайно выбранных здоровых доноров. Положительный эффект предлагаемого способа определения нарушений антигенспецифического клеточного иммунитета состоит в дифференцированном определении нарушений антигенраспознающей и акцепторной (по отношению к эндогенному и энезогенному трансфер-фактору) функций Т-лимфоцитов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4267830/28-14 (22) 23.06.87 (46) 07.11.89. Бюл. ¹ 41 (71) Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (72) В.И.Поздняков и А.H.Мац (53) 615.375(088,8) (56) 1Осипова И.П,, Мап А.H., Туганова В.Е. — Клиническая медицина, 1972, № 4, с. 107-110. (54) СПОСОБ ОП?ЕДЕЛЕНИЯ НАРУИЕНИ11

СПЕЦИ(ьИЧЕ СКОГО Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА (57) Изобретение относится к лабораторной иммунодиагностике в медицине и ветеринарии и позволяет дать четырехстепенную классификаци1о выраженности нарушений клеточного иммунитета на основе диААеренцированной оценки уровня антигенраспознающей функции Т-лимфоцитов и сохранности акцепторной функции T-лил1фоцитов в отношении эндогенного и экзогенного, трансфер-Аактора. Целью изобретения является повышение точности определения нарушения специфического Т-клеточного иммунитета за счет дифференцт1рован ой оценки уровня антигенрасИзобретение относится к медицине и ветеринарии, преимушественно к лабораторной иммунодиагностике, и может быть испо т1 зовано для определения

„„SU„„I 52О44т А1

2 познающей и акцепторной Аункций Тлимфоцитов, Возможность такой оценки достигается тем, что для каждого антигена готовят по два одинаковых ря— да разведений и устанавливают разницу между концентрациями антигена, которые вызывают конгломерацию лейкоцитов в отсутствии и присутствии содержащего трансфер-фактор лимАоцитарного ультрафильтрата, и при выявлешш снижения концентрации антигена в присутствии экзогенного трансферфактора более чем в 2 раза определяют недостаточность эндогенного трансфер-фактора, а при выявлении отрицательной реакции конгломерации лейкоцитов определяют более глубокое нарушение — нарушение акцепции трансферфактора. При этом в качестве источника эндогенного трансфер-фактора используют ультраАильтраты, пр11готовленные из смеси лимфоцитов от 50 или более случайно выбранных здоровых доноров. Положительный эААект предлагаемого способа определения нарушений антигенспециАического клеточного иммунинета состоит в дифференцированном определении нарушений антигенраспоэнающей и акцепторной (по отношению к эндогенному и энезогенному трансфер †Аакто) функций Т-пимАоцитов.

? табл.

НЕДОСтатОЧНОСтИ КЛЕГ(ЧНОГо ПММУНПтP.— та при врожденной 1! пр11обрете иной иммунодефицит ности, прп 11нфекц11онных пРопессах, напР1111 Р пг11 Реllllëlll!TIÐÓEIE1520447 щей герпесвирусной, стафилококковой или туберкулезной инфекции.

Цель изобретения — повышение точности определения нарушения специфи5 ческого Т-клеточного иммунитета эа счет дифференцированной оценки уровня антигенраспознающей и акцепторной функции Т-лимфоцитов по отношению к эндогенному и экзогенному трансферфактору.

Способ осуществляют следующим образом.

Способ основан на реакции конгломерации лейкоцитов свежевзятой крови пациента в присутствии исследуемого антигена. Для каждого антигена готовят по два одинаковых ряда разведений и устанавливают разницу между концентрацией, антигена, которая вызывает 20 конгломерацию лейкоцитов в отсутствии и присутствии содержащего экзогенный трансфер-фактор лимфоцитарного ультрафильтрата, и при увеличении этой разницы более чем в 2 раза судят о недостаточности распознавательной и акцепторной функции Т вЂ” лимфоцитов, лежащей в основе дефицита специфического клеточного иммунитета. При этом используют ультрафильтраты, приготов- 30 ленные из смеси лимфоцитов от 50 или более случайно выбранных здоровых доноров.

Способ включает следующие этапы.

А. Выбор тест-антигенов.

При конкретном осуществлении спо- 35 соба поставлена задача диагностировать нарушение клеточного иммунитета, специфичного в отношении антигенов трех произвольно выбранных пато40 генных возбудителей: вируса простого герпеса (типы I и II), микобактерий туберкулеза и золотистого стафилококка. В качестве тест-антигенов используют коммерческие реагенты: жидкая герпетическая (тканевая, убитая) вакцина, содержащая обезвреженные формальдегидом вирусы простого герпеса I u II типов, очищенный туберкулин — ППЛ (10 мкг/мл в 1Х-ном цитрате натрия на 0,85 -ном хлориде нат50 рия, очищенный стафилококковый белок

А (10 мкг/мл в 1Х-ном цитрате натрия на 0,85Х-ном хлориде натрия).

Б. Приготовление препарата трансфер-фактора.

Препаратом, содержащим трансферфакторы, специфичные в отношении перечисленных антигенов, служит лиофи— лизированный ультрафильтрат, для приготовления которого используют человеческие миндалины, удаленные при хроническом тонзиллите. Взвесь лимфоцитов миндалин, содержащую не менее

95Х живых клеток, готовят не позднее

3 ч после тонзиллэктомии, очищают от адгезивных клеток фильтрацией через синтетическую (полиамидную) вату, осаждают центрифугированием (4008, 20 мин), ресуспендируют дистиллированной водой до концентрации

2 10 клеток в 1 мл и замораживают о при температуре ниже .-20 С. Отдельные порции лимфоцитарного экстракта разо мораживают при 37 С, объединяют так, чтобы смесь содержала экстракт из лимфоцитов не менее 50 доноров, разрушают клеточный детрит, пропуская взвесь через инъекционную иглу при помощи шприца, центрифугируют при

О

6000g в течение 1 ч при 4 С и декаптируют надосадочпую жидкость. Полученный экстракт подвергают ультрафильтрации при 0,15 МПа на мембране с ретенцией 15 КДа. Ультрафильтрат разливают по ампулам и лиофилизируют. Трансфер-Aакторную активность ультрафильтрата контролируют в опытах индукции ГЗТ к трем указанным тестантигенам на мышах и золотистых хо- . мячках.

В. Постановка реакции.

Методом оценки специфического клеточного иммунитета, а также акцепторной функции Т-лимфоцитов в отношении экзогенного трансфер-фактора служит реакция конгломерации переживающих лейкоцитов (РКЛ) периферической крови, которую ставят следующим образом.

Из кубитальной вены исследуемого индивида берут 4 мл крови в 1 мл

5 -ного цитрата натрия и охлаждают на льду. В U-образные лунки 96-луночной панели для микротитрования помещают по 100 мкл 1 -ного цитрата натрия в 0,85 -ном хлориде натрия и готовят в этом растворе серию последовательных разведений с шагом 1:2 для каждого из тест-антигенов, Б ряду из

8 лунок 7 содержат последовательно убывающие разведения антигена, а 8-ятолько 1 -ный нитрат на 0,85Х-ном растворе натрия. Каждый ряд разведений всех трех тест-антигенов повторяют еще раз, пользуясь я качестве

Как и в примере 1, у больного

Е.Б.П. также обнаружены высокие пороги концентраций герпетической вакцины и туберкулина (ППД), вызывающие конгломерацию РКЛ и ареактивность в отношении стафилококкового белка A.

Прибавление препарата трансфер-фактор вызывало достоверное снижение пороговой концентрации герпетической вакцины, т.е. индуцировало иммунореактивность на антигены ВПГ I и II, однако существенно не повлияло на результаты

РКЛ со стафилококковым белком А и туберкулином (ППД). Такой результат интерпретирован как утрата Т-лимфоцитами больного Е.Б.П. акцепторной

5 52044 разводящей жидкости 17-ным раствором цитрата натрия с 0,85Х-ным хлоридом натрия, содержащим препарат трансферфактора (т,е. лимфоцитарный ультра° у

5 фильтрат) в концентрации, эквивалентной 2 10 лимфоцитов в 1 мл. Таким образом, для каждого обследуемого индивидуума на панели готовят по две серии разведений каждого из трех 10 тест-антигенов — одну серию без . трансфер-фактора, другую с ним. Затем в каждую лунку вносят по 100 мкл стабилизированной цитратом крови иссле- . дуемого индивидуума. После этого панель герметизируют адгезивной пленкой, закручивают крышкой и помещают на качалку (120 качаний в 1 мин).при

37 С на 2 ч.

После инкубации из содержимого 20 каждой лунки готовят по две "толстые капли" объемом 50 мкл и диаметром

20 мл на предметных стеклах и оставляют для высушивания при комнатной температуре на горизонтальной поверх- 25 ности. Во время приготовления препаратов "толстой капли" панель находится на термостатируемом подогреваемом столике при 37 С. Высушенные препараты без фиксации окрашивают 0,017. — .30 ным раствором метиленового синего, осторожно погружая предметные стекла в раствор красителя вертикально на

10 мин.

После окрашивания препараты извлекают иэ красителя и высушивают на

35 воздухе. Перед микроскопом всю поверхность окрашенных "толстых капель" . покрывают иммерсионным маслом для просветления и просматривают вдоль 4О продольного диаметра с объективом х 20, отмечая численность лейкоцитов .в конгломератах. Определяют число лейкоцитов в трех самых крупных из встретившихся конгломератов. Именно это число служит показателем конгломерации лейкоцитов в данной лунке, отражающим количество адгезивных лейкоцитов в.исследуемой пробе крови и степень их взаимной адгезивности. Показатели конгломерации лейкоцитов в лунках, содержащих последовательные разведения тест-антигена, сравнивают с показателями 8-й лунки, которая служит контролем. Превьппение показателя на 2 и более единицы (клетки) расценивается как достоверное, Лунка, в которой наблюдается это отличие, содержит пороговую (7 6 концентрацию тест-антигена. Сравнивая пороговые концентрации тест-BH тигенов, вызывающие увеличение показателей конгломерации лейкоцитов без трансфер-фактора и в присутствии трансфер-фактора, судят об его эффекте.

Пример 1. Представленные в табл. 1 результаты РКЛ с кровью больного Д.И.А., 19 18 r рождения, диагноз: рецидивирующий древовидный кератит с поражением стромы правого глаза, свидетельствуют о высоком пороге положительной реакции для всех трех тест-антигенов, что указывает на недостаточность клеточного иммунитета у данного больного в отношении соответствующих возбудителей.

Однако способность Т-лимфоцитов пассиBHо воспринимать специфическую иммунореактивность (т.е., акцептировать экзогенный трансфер-фактор) сохранена, так как в присутствии лимфоцитарного ультрафильтрата наблюдается существенное снижение пороговой концентрации тест-антигенов, вызывающих положительную РКЛ.

Пороговые концентрации тест-антигенов, вызывающие достоверное увели-. чение показателя конгломерации лейкоцитов крови больного Д.10.А., приведены в табл.

Пример 2. Больной F..Á.Ï., 1945 г. рождения, диагноз: кератоувеит левого глава.

Пороговые концентрации тес-антигенов, вызывающие достоверное увеличение показателя конгломерации лейкоцитов крови больного Е.Б.П., представлены в табл. 2.

152044 7 функции в отношении трансфер-фактора, переносящего иммунореактивность к стафилококковому белку А и туберкулину (ППД). Положительный эффект использования

5 предлагаемого способа определения нарушений антигенспецифического клеточного иммунитета состоиФ в дифференцированном определении нарушений антнгенраспознающей и акцепторной функции Т-лимфоцитов.

Формула изобретения

Способ определения нарушений

15 специфического Т-клеточного иммунитета, включающий инкубацию свежевзятой крови исследуемого индивида с серией разведений тест-антигена и учет реакции конгломерации лейкоцитов при пороговой концентрации тест-ан20 тигена, отличающийся тем, что, с целью увеличения точнос1

Таблица 1

Интерпретация

Teer-антигены

Без трансфер— фактора

В присутствии трансфер-фактора

Герпетическая вакцина (РПГ

I и II) мкл/мл

Стафилококковый белок Амкг/мл

Туберкулин (ППЛ) мкг/mr

) 62,5

Снижение порога

То же

1,6

Таблица 2

Интерпретация

В присутствии трансфер-фактора

Без трансферфактора

Тест-антигены

Снижение порога

62,5

250

Без изменений

Слабое снижение порога

6,3

1.2, 5

Герпетическая вакцина (ВПГ I и II) мкл/мл . Стафилококковый белок А мкг/мл .

Туберкулин (ППД) мкг/мл ти способа за счет дифференцированной оценки антигенраспознающей и . акцепторной функции Т-лимфоцитов по отношению к эндогенному и экзогенному трансфер-фактору, инкубирование исследуемой крови и тест-антигена дополнительно осуществляют в присутствии экзогенного трансфер-фактора, а учет реакции ведут по сравпению пороговых концентраций тест-антигена, вызывающих конгломерацию лейкоцитов в отсутствии и в присутствии экзогенногО трансфер-фактора и при снижении пороговой концентрации тест-антигена в присутствии экзогенного трансфер-фактора более чем в 2 раза определяют нарушение акцепторной функции Т-лнмфоцитов, а при отсутствии конгломерации лейкоцитов определяют нарушение антигенрасгознающей и акцепторной функций Т-лимфоцитов.