Способ очистки человеческого @ -интерферона

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для очистки человеческого β-интерферона. Цель - повышение производительности процесса. Раствор сырого интерферона пропускают через обездвиженный синий агарозный гель, элюируют и элюат дополнительно пропускают через хелатметаллический носитель с остатком хелатирования, включающим по меньшей мере ион одного металла из группы CO<SP POS="POST">+2</SP>, NI<SP POS="POST">+2</SP>, ZN<SP POS="POST">+2</SP>. PH контактирования с синим агарозным гелем 5-9.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PECllYEiflHH (51) 4 А 61 K 37/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К OATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21 ) 35930Ю/2" — 14 (22) 16.05.83 (31) 81505/82 (32) 17.05.82 (33) TP (46) 15.11.89. Бюл. Р 42 (» ) Торэй Индастриз, Инк (ТР) (72) Кацуо Хосои и Хитоси Озава (TP) (53) 612.015 (088.8) (56) Положительное рещение по заявке

2838809, кл. А 61 К 45/О?, 29.07.85. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

Р-ИНТЕРФЕРОНА

Изобретение относится к медицине, а именно к способу очистки человеческого интерЬерона, особенно человеческого (3 -интерЛерона.

Цель изобретения — повышение производительности процесса, Способ осуществляют следующим образом.

Сырой интер Ьерон, полученный в результате деятельности клеток человека, обрабатывают обездвиженным синим носителем. Интер*ерон, поглощенный на обездвиженном синем носителе, элюируют элюентом. Затем отбираемый раствор интерАерона обрабатывают хелатметаллическим носителем с остатком хелатирования, включающим по меньщей мере ион одного металла, выбранный l+ ° 2 Ф из группы, состоящей из Со, 3i и

Kn ". ИнтерАерон, поглощенный на хелатметаллическом носителе, отделяют от носителя, получая препарат интерАе„„SU, 1523046 А 5

2 .(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для очистки человеческого f3 -интерюерона.

Цель — повн ение производительности процесса. Раствор сырого интерАерона пропускают через обездвиженный синий агарозный гель, элюируют и элюат дополнительно пропускают через хелатметаллический носитель с остатком хелатирования, включающим по меньщей мере ион одного металла из группы Со, Ni+, Zn . рН контактирования с синим агарозным гелем 5-9, 10 табл. рона больщой чистоты и высокой кон- С центрации.

Раствор сырого интерферона сначала приводят в контакт с обездвиженным синим носителем.

Синий краситель можно обездвиживать Ql на любом из разнообразных обычно ис- ф 1 пользуемых носителей, способном соеди- фф няться с красителем. В число таких носителей входят (А) соединение красителя через амино-группу антрахиноновой части с агарозой, активированной бромистым цианом; (В) соединение кра" сителя с гелем поперечно связанной агарозы способом триазинового соединения через эфирную связь; (С) соеди-,фЬ .некие синего декстрана R (декстран, (1 соединенный с синим красителем, Аирма "Фармесиэ") с агарозой, активированной бромистым цианом методом триазинового соединения; (Д) соединение синего красителя, связанного с

1523046

Для контактирования обездвиженного синего носителя с раствором сырого интерферона можно использовать либо порционный метод, либо колонный спосбб.

Пример 1. Раствор сырого интерферона бып получен путем обработки человеческих фибробластовых клеток в среде МЕМ Игла, содержавшей

0,4% метилцеллюлозы с поли 1; поли

С, с последующей обработкой циклогексимидом и актиномицином Д, К 30 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 6,2 10 им.ед. было добавлено 21 мг

6 белка и 100 мкг, актиномицина Д на

1 л, 30 мп геля синей агарозы (Аффигель блу ® фирмы "Био-Рад"). После перемешивания в течение 40 ч и вы40

55 боковой цепью Аффиа-геля 10® /(Аирмы "Био-Рад лэб." именуемой ниже

"Био-Рад) через пептидную связь с полисахаридным носителем, Можно также использовать другие носители, например поперечно связанный декстраноО вый гель„ например Гефадекс, (фирма "Фармесиэ"), и виниловый полимер с гидроксильными группами, который также можно использовать как носитель для для хелатметаллической хроматогра<<<ии в следующей стадии, предпочтителен гидроАиль п <й гранулированный полимер, например, ТойопЫрл (фирма "Тойо сода комн.") .

Предпочтительно использовать синий агарозовый гель, соответствующий, В), так как он весьма эффективно связывается с интерфероном, не вызывает отделения красителя от носителя, поскольку соединение красителя с носителем является весьма стабильным в условиях рН от 6 до 13, и он легко доступен на рынке. <тот синий.агарозо-g5 вый гель имеет следующую структуру и реализуется под товарным наименованием "Блу сефароз < L-á (фирма "Фарме® < сиэ") "Матрекс гель блу А (фирма

"Амикон корп".) и "Аффи-гель блу® (фирма "Био-P ад" ), О NH

SO H < 3 . 35

О NH NH (N Поперечно свя,г ф Ъ . занный агарозозон Одврживания в течение 3 ч надосадочная жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой физиологическим раствором, содержащим фосфатнокислотный буфер.

Надосадочная жидкость была извлечена снова. Колонну дважды промывали и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (320 мл): раствор 1,0 М хлористого натрия, содержащий 10 мМ фосфор. нокислого натрия (рН 7,2) второй промывочный раствор (280 мл):

25%-ный раствор этиленгликоля содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2) элюент (400 мл):

55%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2).

Получен выход частично очищенного интерферона в элюате(300 мл) 81% от исходного раствора интерферона, очищение в 33 раза.

В колонну с хелатом цинка (10 мп) элюат (285 мл) и колонны геля синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мп/г. После двойной промывки колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (300 мл): дистиллированную воду и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/г в течение 1 ч поочередно второй промывочный раствор (50 мп):

20 мМ раствор лимоннокислого натрия (рН 5,0) элюент:

0,1М буферный раствор уксусная кислота — уксуснокислый натрий (рН 4,5), Выход хелатцинковой хроматографии

87%, а общий выход 70%. Достигнута очистка в 330 раз.

Активность и выход интерферона, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл.1.

5 153304

Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакриламидного геля.

Часть конечного элюата подвергли

5 диализу в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) и лиофилировали. После восстановления лиофилированного диализата 2-меркаптоэтанолом восстановленный материал подвергли электро- 1р форезу с использованием полиакриламидного геля в присутствии НДС согласно способу Лэмпи (Нейчэр, 227, 680-685 (1970)) для проведения анализа активности интерферона и красите- 15 ля с ....... блестящей синью R 200.

В результате активность интерферона и темно-синяя полоса были обнаружены только в положении, соответствовавшем молекулярному весу примерно 20

23000.

Анализ актиномицина Д.

Анализ актиномицина Д был проведен способом биологической пробы.

Часть конечного элюата обессолили 25 путем гель-хроматографии, используя

Сефадекс G 25 после добавления сывороточного альбумина человека (1 мг/мл), Добавляя дополнительно небольшое количество сывороточного альбумина человека и лактозы обессоленный элюат профильтровали через фильтр 2 мкм и лиофилировали. Актиномицин Д был обнаружен в количестве не больше 0,0003 мкг/106 им.ед. ак35 тивности интерферона, Злюат из колонны геля синей агарозы содержал: 0,7 мкг/м актиномицина Д. Общее количество актиномицина

Д составило 210 мкг. Кроме того, при- 4 сутствие актиномицина Д в элюате из колонны геля синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 нм) и путем биопробы.

Часть элюата из колонны геля синей агарозы обессолили способом гельхроматографии с использованием Сефадекс 0-25® после добавленич человеческого сывороточного альбумина.

Удаляя этиленгликоль, обессоленный элюат лиофилировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/10 им.ед, 6 интерферонной активности актиномицина Д, Пирогенное испытание на кроликах.

Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилированный материал инъектировали внутри венно трем кроликам (2 ° 10 им.ед./кг

6 6 массы кролика). Суммирование пнреко сии для всех трех кроликов было О,б С.

Интерферон, очищенный по предлагаемому способу, оказался отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах.

Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны геля синей агарозы, инъектировали внутривенно трем кроликам (2.10 им. ед/кг массы кролика ). Суммирование пирексии для всех трех кроликов было 1,5оС. Интерферон, очищенный согласно способу хроматографии синей агарозы, оказался неопределенно отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах.

Пример 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интерферона, подобный использовавшемуся в примере 1, 20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей агароэы объемом 20 мл (Матрекс гель блу А®, фирмы ",Амикон корп"), Колонну трижды промыли и элюировали.

Использовали следующие промывочные растворы и элюент. первый промывочный раствор (200 мп):

1 М хлористый натрий, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2). второй промывочный раствор (200 мл):

25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2). третий промывочный раствор (40 мп);

407-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и М хлористого натрия (рН 7,2), элюент (200 мл):

55Х-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия, Хелатцинковую колонну (5 мл) соединили с выходом колонны синей агарозы после начала элюирования, и элюат из колонны синей агарозы непосредственно пропускали через хелатцинковую колонну. Затем хелатцинковую колонну дважды промыли и элюировали.

Промывочные растворы и элюент были следующими.

1523046

35 первый промывочный раствор (200 мл): дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) поочередно второй промывочный раствор (20 мл): .20 мМ лимоннокислый натрий (рН 5,0): элюент:

0,2 М буферный раствор уксусная кислота — уксуснокислый натрий, содержащий 1 M хлористого натрия.

Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл.2.

Пример 3. 20-л раствора сырого интерферона с интерферонной ак- тивностью 15 10 им. ед. и 60 мг/л

6 общего белка контактировали с 40 мл синеагарозного носителя (Матрекс гель Блу А® Фирмы "Амикон корп.").

Носитель, на который был адсорбирован интерферон, загрузили на колонну. Затем колонну дважда промыли и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор

30 (400 мл): раствор хлористого натрия 1 М, . содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2). второй промывочный раствор (400 мл):

25 -mN раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ Фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7в2).

40 элюент:(400 мл).

100 мл раствора интерферона, отобранного из колонны синей агарозы, пропустили через 5 мл хелатникелевую колонну. Использованная колонна хелата 45 никеля была. приготовлена так же, как в примере 1, за исключением того, что вместо раствора хлористого цинка использовали раствор хлористого никеля °

Хелатникелевую колонну промыли и элюировали. Испольэовали следующие промывочный раствор и элюент: промывочный раствор( дистиллированная вода и 0,1 М

Фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали поочередно

55 элюент .

0,2 M буферный раствор уксусная кислота — уксуснокислый натрий, содержащии 1 М хлористого натрия (рН 4,5).

Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл.3.

Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогенных веществ и был отрицательным относительно испытания Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д.

Пример 4. Была повторена процедура примера 3 за тем исключением, что хелаткобальтовую колонну использовали вместо хелатникелевой колонны, причем хелаткобальтовую ко-, лонну приготовили как в примере l йо вместо хлористого цинка использова( ли раствор хлористого кобальта.

Злюат (15 мл) содержал 4,5 ° 10 им, 6 ед..интерферона (выход 60 ) и 0,25 мг белка. Удельная активность составляла 1,8 10 им, ед.!мг белка. КонечВ ный элюат был отрицательным к испытанию Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д.

Пример 5. Культивировали, штамм Е. коли, в котором был интегрирован структурный ген Р-интерферона, и культивированный штамм. подвергли процедурам сбора бактерий, измельчения бактерий, удаления нуклеиновой кислоты и осаждения сульфатом аммоний, Белковую фракцию, содержащую

В-интерферон, .полученный из штамма

Е.коли, растворили в 25 -ном растворе этиленгликоля, содержащем 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2), с целью получения раствора сырого интерферона. Раствор сырого интерферона имел интерферон-, ную активность 5 ° 10 им,ед. и 20 мг

6 белка на 1 мл.

40 мл раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мл синей агарозы (Матрекс .гель блу А® фирмы "Амикон корп."), уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натрия, содержащим 1 М хлористого натрия, Колонну дважды промыли с целью удаления примерно 95 белка в растворе сырого интерферона, и элюировали с фракционированием в каждую фракцию 2 мл, Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (10 мл):

25 -ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого нат9 15?3046 lO рия и 10 мМ фосфорнокислого натрия второй промывочный раствор (10 мп)

40 .-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 M хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия элюент.

60Х-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия, Элюат (12 мл) из колонны синей агарозы имел интерферонную активность

1,6 *1О им.ед. (выход 80 ) и 4,6 мг балка. Средняя удельная активность в каждой фракции была 2,5 ° 10 им,ед,/мг белка (макс. : 5.10 им.ед./мг белка), Элюат подвергли анализу так же, 20 как в примере 1. В результате чистота интерферонной активности при молекулярном весе примерно 19000 составляла

10-50 . (средняя 25 ).

6 мл элюата из колонны синей агаро-д зы пропустили через 1 мп хелатцинковой колонны, уравновешенной 60 -ным раствором этиленгликоля, содержащим

1 M хлористого натрия и 1 мМ фосфорнокислого натрия. Колонну трижды про- 30 мьши и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (6 мп):

60 -ный раствор этиленгликоля содержащий 1 M хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого

35 натрия второй промывочный раствор (6 мл): дистиллированная вода .третий промывочный раствор (6 мп):

220 мМ буферный раствор фосфорнокислого натрия, содержащий

2 M хлористого натрия (рН 6,0). элюент.

0,1 М буферный раствор Уксусно- 45 кислого натрия, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,0).

Конечный элюат (4 мл) имел интерферонную активность 4,0 10 им.ед.

7 (выход 50 ) и 0,4 мг белка. Удельная активность была 1.10 им. ед./мг бел8 ка.

Конечный элюат подвергли анализу как и в примере 1 и обнаружили одну полосу в положении молекулярного веса примерно 19000. Чистота была больше

97 .

Пример 6. Была повторена процедура примера 3, за тем исключением, что вместо хелатникелевой колонны использовали хелатцинковую колонну и в качестве элюента использовали 0,2 М раствор 1гистидин, - уравновешенный хлористый натрием (рН 7, О }, Элюат (20 мп) имел 50-10 им.ед. интерферона (выход 67 ) и 50 г общего белка. Удельная активность быпа

1,0.10 им.ед./мг белка.

Пример 7. Использовали сырой интерферон, полученный из .человеческих фибробластовых клеток, аналогичный интерферону, использованному в примере 1.

К 20 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 42 ° 10

6 им.ед. и концентрацией белка -70 мг/л добавили 30 мп геля синей агарозы (Ms%rex Gel Blue А® "Аппсоп согр". )

После перемешивания смеси в течение

3 сут и выдержки в течение З ч удалили надосадочный слой и гель синей агарозы пропустили через колонну, промывая 200 мп 1,0 М раствора хлористого натрия, содержащего 10 мМ фосфата натрия с рН 7,2 (буфер А), Затем колонну дважды промыли, Перед элюированием интерферона для улучшения очистки к выходу вышеука-. занной колонки подсоединили колонку. с 15 мп свежего геля агарозы, уравновешенного буфером А, содержащим

25 -ный раствор этиленгликоля, После третьей промывки интерферон элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (200 мп) буфер А второй промывочный раствор (300 мп), буфер А, содержащий 25Х-раствор этиленгликоля, третий промывочный раствор (120 мп), 3 М раствор хлористого натрия, содержащий 30 мМ фосфорнокиелого натрия (рН 7,2) и 30 -ный раствор этиленгликоля элюент (600 мл): буфер А, содержащий 55Х-ный раствор этиленгликоля.

Раствор элюата фракционировали.

Результаты представлены в табл.4.

Фракцию второго элюирования подвергли дальнейшей очистке с помощью хелатцинковой хроматографии.

В колонну с хелатом цинка (15 мтт) ввели буфер А, содержащий 50 .-ный

1523046

l2 раствор этиленгликоля. Часть (270 мп) фракции второго элюирования иэ вышеуказанной колонны синей агарозы развели 27 мл буфера А до получения

50 -ного раствора этиленгликоля и. пропустили через колонну с хелатом цинка при скорости потока 30 мл/ч.

Все операции проводили при температуре 2-8 С. После двойной промывки колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (200 мп) дистиллйрованную воду и 0,1 М раствор фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/ч в течение

1 ч поочередно второй промывочный раствор (30 мп):20

2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мМ фосфорнокисло-. го натрия (рН 7,2) элюент4

0,1 М уксусной кислоты — уксус25 нокислого натрия буферный раствор, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН 7,4).

Активность, выход интерферона, количество. белка и удельная активность этой процедуры очистки представлены в табл.5.

Интерферон из колонны с хелатом цинка подвергли анализу посредством электрофореза полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) для определения чистоты. Элюат подвергли пирогенному испытанию с

I помощью теста Лимулуса, используя 40 обнаруживающий эндотоксин реагент.

Чист та интерферона 90, элюат отрицательный к испытанию:. Лимулуса при содержании интерферона 1,6 l0 им. б ед. /мл, 45

Сравнительный пример .l. Во вторую колонну геля агар озы (Mat rex Gel

Blue А 4 мл) загрузили 2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мМ фосфорнокислого натрия, рН 7,2 (буфер В).

Час ь .,р к ли (45 мл) второго элюирования из кы онпы геля синей агарозы,.описа чой в прим рс, разбавили

5 мл буфера А и 75 мл буфера В и про- 5 пустили через вторую колонну геля синей агарозы при скорости потока

20 мп/ч. Все операции проводили при

15-25 С.

Вуфер, содержащий 30, 40 и 50 .— ный раствор этиленгликоля соответственно пропустили через колонну со скоростью потока 20 мл/ч.

Результаты второй хроматографии геля синей агарозы представлены в табл.6.

Интерферон иэ элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликоля, из которой колонны геля синей агарозы подвергли. такому же анализу, как в примере 7, для определения его чисто» ты и проведения пирогенного испытания.

Чистота его была 60 и результат испытания Лумулуса положительный, Сравнительный пример 2. Колонну из хелата цинка (50 мл) уравновешивали при помощи РВЯ. Неочищенный интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30> 10 ме/мп и концентрацию протеина

70 мг/л, пропускали через колонну хелата цинка с объемной скоростью

100 мл/ч. После промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор и элюент . промывочный раствор (400 мл). дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натрия (рН

6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч в течение

1 ч, с чередованием элюент:

0,1 N буферный раствор уксус-. ной кислоты — ацетата натрия, содержащий 1.0 М хлорида натрия (рН 4,7), Фракцию элюирования на колонне хелата цинка использовали для последующей очистки при помощи хроматографии на голубом агаре, Колонну из голубого агара (5 мп) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты — ацетата натрия, содержащим 1,0 М хлорида натрия. Фракцию элюирования из вышеупомянутой колонны халата цинка пропускали через колонну. с голубым агаром с объемной скоростью 10 мл/ч. После двухкратной промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочный раствор и элюант ., первый промывочный раствор (50 мл)

1,0 М раствор хлорида натрия.

13

14

1523046 содержащий 10 MM фосфата натрия, рН 7,2 (буфер А), второй промывочный раствор (50 мп):

6yhep А, содержащий 25 этиленгликоля: элюант: буфер А, содержащий 55 эти тенгликоля °

Раствор элюата подвергали фракционированию. Результаты приведены в табл. 7.

Сравнительный пример 3. В качестве исходного материала использовали неочищенный интерферон фибробласта, . который имел активность интерферона

7,7 10 ме/мп и концентрацию протеина 35 мг/л. Этот исходный раствор (2,0 л) смешивали с 5 г (17 мл) шариков "ЦРГ" (пористыми стеклянными maриками с размером пор 350 А) и смесь энергично перемешивали в течение . 13 ч. Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр и шарики ЦРГ упаковывали в колонну (диаметр 0,9 см), . Далее колонну промывали )00 мп PBS, а затем 0,01 М раствором глицина-НС1 при рН 3,5, и элюировали 0,3 M буфером глицина-НС1 при рН 2,0, содержащим 0,1 мг/мп альбумина сыворотки человека.

Элюаты подвергали диализу с использованием 4 ° 1 л 1 М раствора NaCl буферированного 0,02 M раствором фосфата (рН 7,4).

Диализированный раствор"пропуска35 ли через колонну с хелатом цинка с размерами 0,6 ° 7 см,затем колонну промывали 10 мл 1 M раствора хлорида натрия, . буферированного О, 02 M раствором фосфа40 та (рН 7,4) и 10 мл О, 1 M буфера ацетата натрия (рН 5,9). Затем колонну элюировапи 0,1 M буфером ацетата натрия (рН 4).

Полученные резуль гатьт приведены 45 в табл.8.

Сраттттитепьный тптт т р 4. Используи:и е< т1 r и че.<т< вече< нт и т<ттбробластный интарфе: и „атта<тс ги <" sòrèîëüçóåìo—

:ту в пример е 7.

Paròâîð сыр <т о ттпт т рАт рона, имеющего актт|ттттость итт т ерферотта 38 10 им. ед./л, конттентраттттю белка 63 мг/л и удельную активность 6 10 им.ед./мг

55 белка, регулируют до рН 2 путем добавления 6 н. НСl и загружают в колонку HP-Сефадекоа (20 мл, 2 см

<6,4 см). После -;агрузки 6 л раствора сырого интерферона со скоростью потока 40 мл/ч колонку промывают

2ОО мп дистиллированной воды. Затем колонку элюируют 320 мл 0,1 M буферного раствора фосфорнокислого натрия (рН 8,3). Раствор элюата фракциони" руют. Результаты приведены в табл.9.

Вторую и третью фракции элюирования используют для последующего способа очистки путем хелатцинковой хро-, матографии.

Колонну с хелатом цинка (3 мл, 1 см 3,8 см) уравновешивают 0,1 М буферным раствором фосфорнокислого натрия (рН 8,3). Вышеуказанные фракции (300 мп) из колонки HP-Сефадекса пропускают через хелатцинковую колонну со скоростью потока 6 мл/ч. После промывки дважды колонну элюируют. Используют следующие промывочный раствор и элюент.

9 первый промывочный раствор (40 мп): дистиллированная вода и 011 M раствор фосфорнокислого натрия

1рН 6,71, используемые пооче-. редно со скоростью потока

6 мл/ч в течение 1 ч второй промывочный раствор (6 мл):

2 М хлористый натрий, содержащий 20 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2) элюент.

О,1 M буферный раствор уксусная кислота — уксуснокислый натрий, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН 4,7)

Результаты этого способа очистки приведены в табл.10.

Используемый в качестве исходного материала раствор сырого интерферона ! имеет рН 7,3. После отстаивания в течение 10 дней его интерферонная активность составляет 38 10 им.ед./л и никаких изменений в активности интерферона не обнаружено. Тогда .как после отстаивания в течение 1О дней раствора сырого интерферона, имеющего рН 2, перед загрузкой его в колонку

БГ-Сефадекса, интерферонная актив6 ность снижается до 16 10 им.ед./л..

Это означает, что раствор сырого интерферона неустойчив при рН 2.

Изобретение имеет следующие существенные признаки и преимущества по сравнению с известным техническим решением.

Способ очистки в соответствии с известным техническим решением вклю15

1523046

Извлечение,Е

Пример

Сравнительный 45 пример

I-я очиститель36 ная стадия

2-я очиститель69 ная стадия

Применение известного способа ограничивается сырым интерфероном с относительно нИзкой концентрацией, Предлагаемый способ применим к сырому интерферону как с низкой концентчает SP-Сефадексовую хроматографию на колонках с последующей хелатметаллической хроматографией. Сырой интерферон, очищаемый в соответствии с известным способом, имеет низкую концентрацию, например используемый в примере 1 сырой интерферон имеет активность интерферона 3,2 10 им, 6 ед./л и концентрацию белка 20 мг/л, а используемый в примере 2 сырой интерферон имеет активность интерферона 5 10 им.ед./л и концентрацию бель ка 25 мг/л. Известное техническое решение имеет в виду очистку сырого интерферона с относительно низкой концентрацией.

Предлагаемый способ очистки включает хроматографию на обездвиженном синем носителе с последующей хелат- 20 металлической хроматографией. В соответствии .с этим способом очистки ebtрой интерферон с высокой концентра цией (например, сырой интерферон, используемый в примере 7, имеет ак- 25 тивность интерферона 42 10 им.ед./л б и концентрацию белка 70 мг/л) может быть удовлетворительно очищен.

Кроме того, как видно из примера

7, в котором использовали сырой интерферон с высокой концентрацией, извлечение продукта по известному способу составило самое большое 47%.

Таким образом, известный способ непригоден для очистки сырого интерферона с высокой концентрацией. Это становится более очевидным из сравнения результатов примера 7 с. результатами сравнительного примера 4 (в обоих примерах материалом для очистки был сырой интерферон с высокой концентрацией). рацией, так и с высокой концентрацией.

Известный способ имеет недостаток, заключающийся в том, что перед з агрузкой колонки SP-Сефадекса сырой интерферон обязательно делают cHJIbHoKHcJIo THblMp поскольку интерфвронная активность при таком кислотном состоянии заметно теряется, как показано в сравнительном примере 4.

Этот недостаток известного способа не обнаруживается в изобретении, поскольку хроматографию на обездвиженном синем носителе осуществляют в условиях почти нейтрального рН.

Пример 8. Используемый раствор неочищенного интврферона получают путем обравотки клеток человеческого фибробласта с использованием методики, аналогичной примеру 1. .К раствору неочищенного интерферона, который имеет активность интерферона, равную 30000 ед./л, белковую концентрацию, равную 0,11 мг/мл и рН 7,2, прибавляют 6 н. раствор НС1 или 1 н. раствор МаОН с тем, чтобы довести рН до 2,3, 4,5,6,7,8,9 или

10.

Устойчивость каждого раствора неочищенного интерферона испытывают путем определения титра, оставшегося после отстаивания каждого раствора неочищенного интерферона при температуре 4 С в течение 16 ч, Ниже приведены результаты испытания, выраженные в процентном содержании рН Устойчивость,%

2 83

3 69

4 80

5 90

6 97

7 100

8 98

9 94

10 80

Затем 15 мл каждого раствора неочищенного интерферона помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку, в которую также помещают 0 05 мл синего красителя в качестве носителя (Ма1гех Gel Blue А®)и смесь перемешивают при 4" С в течение 16 ч. После удаления надосадочного слоя и промывания дважды 2,5 мл 10 мМ раствора фосфат натрия — 1 н. NiE. l (рН 7,2) 2 мл

17

1523046

Таблица1

Общий белок, мг

Общая активность интерферона, «10 им.ед.

Удельная активность, им.ед/Mr белка

Объем, Выход, %

Характеристика

3,0 10

630

30,000 186

32,000 3

570

0,2

320

1,4

280

1,0 10

150

300

143

285

285

1,8

0,6

300

64

124

2,5 10

6 ° 107

4. 10

1,0 1О

1,0

0,16

1,2

32

34

10 мМ .фосфата натрия — 1 í. NaCl (рН 7,2), содержащего 55%-ный этиленгликоль, прибавляют к носителю. После центрифугирования удаляют надоса5 дочный слой, содержащий частично очищенный интерферон.

Затем определяют количества потерянного интерферона (общее содержание интерферона, не абсорбированного на носителе, и интерферона, содержащегося в промывном растворе) и восстановленного интерферона.

Ниже приведены результаты >выраженные в процентном содержании. 15 рН Потеря, Восстанов% ление, %

2 5

3 13 50

4 20 46

5 9 65

6 7 70

7 7 68

8 8 73

9 6 67 25

10 6 50

Исходный материал

Раствор сырого интврферона

Колонны геля синей сахарозы

Надосадочная жидкость

1-й промывочный раствор

2-й промывочный раствор

Фракция элюирования

Хелатцинковая колонна

Загрузочный раствор

Пропускаемый раствор

1-й промывочный раствор

2-й промывочный раствор

1-я фракция элюата

2-я фракция элюата

Общая фракция элюата

Как видно из вьппвприведенных результатов, когда рН раствора неочищенного интерферона был доведен до

5-9, раствор неочищенного интерферона оставался устойчивым и восстановление частично очищенного интерферо" на было высоким.

Формула изобретения

Способ очистки человеческого Р-ин-. терферона путем контактирования раствора неочищенного интерферона с сорбвнтом, обработки сигнала элюантом с последующей металл-хелатной хрома-: тографией полученного элюата, при которой носитель содержит хелатообразующий остаток, а в качестве иона—

Со+ или Ni или Zn и элюции це° 4. 2 +а левого продукта гистидином или кислотным буферным раствором, о т л и " ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения производительности процесса, в качестве сорбента используют синий агарозный гель, а контактиро" ванне проводят при рН 5-9.

1523046

Общая интерферонная акВыход, %

Общий белок, мг

Объем

1240 l,l 10

10бО

200

0,7

200

14 20

1,0 10

20

1,4 5

0,9 2

19 1

200

200

1,3

2, 7 10

2,1 10

27

0,4

Таблица3

Характерист

1200 2,5.10

1,0 10

270

260

400

65 100

0,7

0,55

1 ° 10

20

Хар актеристика

Исходный материал

Раствор сырого интерферона

Раствор, пропущенный через синеагарозную колонну

1-й промывочный раствор

2-й промывочный раствор

3-й промывочный раствор

Хелатцинковая колонна

Пропущенный раствор

1-й промывочный раствор

2-й промывочный раствор

Общая фракция элюирования

Исходные материалы

Раствор сырого интерфероиа

Колонна синей агарозы

1-й промывочный раствор

2-й про:ывочный раствор

Злюент

Хелатникелевая колонна

3 а груз очный раствор

Пропущенный раствор

1-и промывочный раствор 2-й промывочный раствор

Элиат тивность, -10 им,ед, 20,000 142

20,000 10

20,000 300

0,7 110

Т а б л и ц а 2

Удельная активность, им.ед,/мг белка

2 ) 22

1523046

Общий белок, мг

Выход;

Общая интерферонная акОбъем, л тивность, «10 им.ед.

1375 61

1170 1,7

2,4

14 7

0,4

0,1

0,32

1,3

0,12

1,4

12

0,03

71 24

1,3 2

550

0,42

0,12

Общая интерферонная активОбъем, л ность, «10 им.ед.

6 белка

390

15,4 2500

300

6 11 200

13 5 1,0 5200

69 0,9 30000

22

52

270

248

Та блиц аб

Х ъе

2500

125

2,5

125

1,6

1,7

0,21

3300

26

17000

0,15

7100

0,07

Характеристика

Раствор сырого интерферона

Надосадочный слой

1-й промывочный раствор

2-й промывочный раствор

3-й промывочный раствор

1-я фракция элюирования

2-я фракция элюирования

3-я фракция элюирования

Характеристика

Раствор сырого интерферона

Пропущенный через колонну

Промытый

Фракция элюирования

Раствор сырого интерфер она

Пропущенный через колонну

Элюирование

30%-ным раствором этиленгликоля

40%-ным раствором э тиленгликоля

50%-ным раствором этиленгликоля

Выход, Общий

% белок, мг

Таблица4

Удельная активность, «10 им,ед./мг ф белка

Таблица5

Удельная активность, «10 им.ед./мг

1523<)46

Табли2227

Извлечение, r

Общая акTHBH0CTb

ИФН, 2210 ЕИ

Удел ьная ак"

Общее содержание

Объем тивпротеина, мг ность, <10

ЕИ/мг протеина

75

280 43

240 5

4 125

2,4 3750

300

12

90

<0,4

0,2

0,8

0,)2

0,23

2 5

5300 33

6700 17

5700 50

0,75

0,30

1,05

Удельная активH0C Ü

ЕИ!мг

Общее содержание протеина, мг

Объем, MJI

Из вле-.. чение, Ж

15,4 10

1,8 10

64

2210

0,2 10

0,1 10

7,0 10

109

125

5,1 10

0,34

6,5

Характеристика

Колонна из хелата цинка

Неочищенный ИФН

Пропускается через

Промывка.

Фракция элюирования

Колонна из голубого агара

Пропускается через

1-я промывка

2-я промывка

Фракция элюирования

1-я

2-я

Всего характеристика

Исходный раствор

CPQ

Пропускается через + ,промывка

1-я фракция элюирования 45

2- я фр акция элюирования 46

3-е элюирование 48

Диализированный раствор

Колонна из хелата цинка

Пропускается через + промывка

Фракция элюирования

Общая активность ИФН

ЕИ (30 0,1

120 0,2

310 2

Таблица8

2,4 10 100

1,3 10 69

0,9 10 45

0 0

1,5 10 33

26

Таблица9

1523046

Извлечение,%

Удельная активность

«iO им.ед./мг ф белка

Общая активность интерферо на, «10 им.ед бщий

Объем, Характеристика елок, мг

Внесенный раствор 6000

Пропущенный + промытый

ЭЛюирование

Фракция 1 20

Фракция 2 150

Фракция 3 150

378

228

Таблица10

Извпечение,%

6,8

0,2

32,5

3,5

12,4

0,4

74

Общая активность интерФеро на, «10 им.ед

6 бщий

Удельная . активность, «10 им.ед/мг белка

Хар актери стика

Объем, мп елок, мг

Внесенный раствор 300

14,4

9,3

0,23

lO

Пр опущенный

Промытй

Элюирование:

Фракция 1

Фракция 2

0,9

0,03

0,4

0,01

2,4

4

0,8

0,45

10000

Составитель А. Агуреев

Техред Л.Сердюкова

КорректорМ. Максимишинец

Редактор Н. Киштулинец

Заказ:6985/59 тираж 643 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101