Способ криосохранения генофонда сортов и видов картофеля

 

Изобретение относится к биотехнологии ,, а именно к криогенным методам хранения живых клеток и тканей растений, в частности меристем,и может быть использовано в селекции и сенеНСводетse для длительного сохранения генофонда картофеля. Целью изобретения является повышение надежкости криосохранения, увеличение жизнеспособности апексов и обеспечение щентичности регенерированных растений исходным. Cnoccf6 состоит в том, что в качестве исходного материала для вычленения апексов беру г заведомо здоровые стерипьные растения , выращиваемые в строго контро- nifpyewbix условия :, в раствор криоиротектора пподят дополнительно сахарозу в концентрации 5-10Z, в питательную среду вводят аденин в концентрации 10-40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, одиовреьтенно нс.--;почая из среды ауксины и гнцролиэат казеина. 3 табл. г СО

союз советсних социАлистичесних

РЕСПУ Блин

II@> 011

524479 A I

{51 С 12 N 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОО1яАРОТ8енкый кОмитет по иаков етениям и атн1ытиям т1 и гнит ссср (4б) 15, 10.90, Бюп. Ф 38 (2! ) 4373961/31-13 (22) 29, 12 .87 (71) Институ". физиологии растений им. К.А.Тимирязева и Научно-г,роизводственное объединение по картофелеводству Госагропрома РСФСР (72) Ч.В.Донец, А.С.Попок

H P.Ã.Áóòåíêo (53) 578.085.23 (088.8) (56) Ианжулин А.В., Бутенко P.Ã., Попов А.С. Влияние подготовки алексов картофеля на их жизнеспособность после глубокого замораживания, Физиология растений, 983, т. 30, Р б, с. !188. (54) СПОСОБ КРИОСОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к криогенным методам хранения живых клеток и тканей

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к криогенным методам храпения живых клеенок и тканей растений, в частности алексов (меристематическнхк керх,шек побегов) и може быть использовано в селекции н семеноводстве для длительного сохранения генофонда картофеля.

Белью изобретения является повышение надежности криосохранения, увеличение жизнеспособности апексов и обес" печение генетической идентичности ре" генерированных растений исходным.

Способ состоит в том, что в качестве исходного материала для вычленения апексов берут заведомо здоровые сте2 растений, в частности меристем,и может быть использовано в селекции и семенокодетве для длительного сохранения генофонда картофеля. Белью изобретения является повьаиенне надежности криосохранения, увеличение жизнеспособности апексов и обеспечение идентичности регенерированных растений исходным. Способ состоит в том, что в качестве исходного материала для вычленения .апексов берут заведомо здоровые стерильные растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в раствор криолротектора вводят дополнительно сахарову в концентрации 5-10Z, в питательную среду вводят адении в концентрации 10"40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, одновременно ис..:..ночая из среды ауксины и гидролизат каэеина. 3 табл. рильные растения, выращиваемые в строго контролируемых условиях, в р раствор крнопротектора дополнительно вводят углеводы, в частности, сахарову в концентрации 5-!ОХ, в питательную среду вводят дополнительно аденин э концентрации 10-40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, одн овременно исключая из среды ауксины н гидролиэат казеина.

Сущность изобретения заключается в замене исходнзго материала для выделения апексов на наиболее высококачественный в модификации питательной среды для их предварительного культивирования и рекультивирования

1524479 после оттаивания и.введения дополнительных, помимо ДИСО криопротектос ров, в качестве которых используются углеводы в частнрстн caxaposa в конВ

5 центрации 5"1ОХ. -Наиболее высококачвствениый материал представлен коллекциями вполне оздоровленных стерильных растений в пробирках, имеющихся

Во всех селекцентрах и мировых цент-

10 рах генофонда картофеля и насчнгывающих сотни и тысячи различных сортов и форм. Такие коллекции являются непременным этапом современнага интенсивного семеноводства картофеля и поддерживаются клональным л1икрораэм.ножением в строго контролирус яа, лабораторных условиях, т.е. они аксимально стандартизованы. ilp» их использовании искпючается стем, пзация проростков перед вычленением .лэ них апексов. Модификация питателы.ой среды для апексов, с одной стороны, ослабляет рост их клеток растяжением

s период предкультнвирования, что уменьшает вакуолиэацню и овадненность клеток и благоприятно для ж 13ыжи13а-, ния во время экстремальной процедуры глубокого замораживания и посиедующего оттаивания. С другой сх 3ро11ь, 1 предлагаемая модификация палнос гъю предотвращает каплусообраэование в период рекультивирования после оттаивания, обеспечивая толька прямую регенерацию, Введение в состав раствора криопротектора углеводов, в частн1 сти,15 сахарозы, каждая молекула которой связывает четыре молекулы воды, не только уменьшает токсичность ПМС0, на и увеличивает вязкость раствора, сокращая объем образования льда, скорасть его распространения и вссроятность повреждения им клеток. Onltotlprменна, проникая вслед за ДИСО : «л1-т-ки, углеводы связывают воду и внутри пих, предотвращая черезмерное сжатие протапласта в процессе медленногo замораживания, Снабжение пакета с алексами фитилем н его расиоложе 1ие позволяет максимально снизить объем раствора в ампуле, значительна ус .:о.ряя оттаивание, чта сокраща т вероя;— ность повреждений на этом этапе эа счет роста возникающих при,.; 31.вживании центров кристаллизации.

Способ иллюстрируется ирил3с ра11и ° 55

Дчя замораживания исиольэу13т а11 ел.

cbI размером 300-450 мк:1, 13hl, иим )1.3 пазух л 1стьев средней ласт11 . и- . H дневных стерильных растений культ) рного тетраплоидного вида картофеля сорта "Да1лодедовский". Предварительная подготовка апексов заключается в кугьтивировании их на жидкой питательной среде, модифицированной, как указано вьш1е, н течение 24-26 ч, причем последние 16 ч иэ этого срока в присутствии добавленных к среде криопро" текторов". 5Х ДМСО и 5Х сахароэы. Условия культивирования растений: темпе" ратуi3a 22-23 С,.влажность 60-70Х, освещенность — 5-8 тыс лк, фотопериод .о

16 ч/сут; аиексов: 26 С, влажность

60-75Х, освещенность 5-8 тыс.лк, фотопериод — 24 ч. После подготовки алексы в пакетике иэ фильтровальной бума" ги, снабженном фитилем, переносят в ампулу под пробку, располагая пакетик вдоль боковой стенки так, чтобы фитиль и иакети1: прилегали к ней вплотную и фитипь опускался дс дна. В амir;I..3 IIarIui3aiox 0,2-0,3 мл вышеуказанноl o раствора криопротектароь, охлаждают ам11уль1 в ледяной бане, а затем в ира1р."минам эаморажнвателе со скоростью 0,5О С/1ин. При температуре -4,5 С

13ро11эводвт затравку сразу всех ам Зул, 11 1хад 1щих. я в сиециалъном штативе, путел ирнхоснсве 1ия их дна к поверхности жи 1кого азота в течение 0,8t

0,3 с, Дпя затравки возможно также

11спол1 .3ование специального устройства. ,ели программный эамараживатепь оснаЩЕН ИОДСОНЬ1;1 .rC.тРОйСтВОМ, КОТОРОЕ ПОзволяет избежать кратковременного наруп1еиия режима в камере замораживания.

В обоих случаях апексы отдалены от эаиы с3браэования и первоначального быстрого рос га кристаллов льда в мо1РН. 3атравки It не мо.ут быть повреждены в этот момент. После этого темпсратуру а камере замораживания поддерживают не у13онне -5 C в течение lO20 мин, а затем продолжают ахлажде ие с первоначальной скоростью до ° о

-40 С, после чего сразу погружают в жидкий азот (-196 С). После хранения в жидком а 1ате ампулы быс rpo раэмаракиввют, 3стрях11вая 8 воде при 40 С, затем 11лиулы в пвдянсй1 бане быстро переносят 1 стер13пьиые условия и алекСЫ Вме,.,к13вашт На аГарИЗаьазяуЮ Сраду тоге жp с 3става. Условия рекультивирова ия в и. pl;;:e сутки так.;е же, как

И ДЛЯ ИР ДК;:3 —-. -..Iir ИР ляаяИЯ аПЕКСаВ, На

:rctr rcerr,-3аст1 — от 100 до 1;000 лк. 1ереэ 2- ч, на с;:едуощие сутки и в

1524479

5 6 дальнейшем через каждые 5-7 дней апек- бель разделяют иа микрочеренки, котосы пересаживают на свешув вгариэован- рые переносят в пробирки для укореHylo среду, продолкая рекультивирова- нения. ние в условиях, укаэанных выше для В табл. ) приведены реэультвты, порастений. После возобновления роста лученные по предлагаемому способу, в и развития и образования сильного ете- зависимости от состава раствора криолющегося по чашке стебля, этот сте- протекторов.

1 Таблица )

Влияние состава криопротекторов на киэнеспособность апексов и регистрацию растений

Вариант

Конечная концентрация криопротекторов, X

Количество апексов, Х

ДИСО глицерин сахаposa образовавших каллус вьвкивших регеиериров евших растения в теч.

I мес, Таблица 2

Влияние возраст» нс кодных стерилькых растений мн выход растенийрегевераитсв после глубокого saморавивання и оттаивания апексов

Возраст исходных растений, дии

Числv апексов, регенерировавших растения, 26

28

32

36

82

33

14

l0

Таблица 3

Влияние содеркания аденина в питательной среде на скорость роста регенерантов иэ меристем картофеля

Длииа регецерантов (мм/месяц) Вариант (содержание аденина в среде, мг/л) сорт Ломодедовский мм 7. к контролю сорт Друииый сорт Славянский мм Х к контролю

Х к контролю мм

l,356

2,563

3,005

5, 106

6,440

l, l l4

2,595

3,519

5, 300

6,483

189,0

221,6

376,5

474,9

1, 210

2,700

3,103

6,725

6,723

232,9

315,9

475,8

582,0

223, 1

256,4

555,8

555,6

Контроль: беэ аденина

О, 5

5,0

10,0 20,0

5 0

5 0

5 0

5 . 0

5 5

5 5

5 5

-5

l0

20 1 с

10

82

0

41

О

0

0

82

0

24

1524479

Продолжение табл.3 °

»»Oi t Вариант (содержание вденина в, среде, мг/л) » Ь °

Длина регекерантов (мм/месяц) сорт Дружный

° сор с Славянский сорт Домодедовский мм Х к конт» ролю

X к контролю

Х к контмм ропе

40,0 60,0

80,0

НСР 71157

4t918

4,205

0,487

591, 5

406,4

347,5

40.2

6,71!

4, 188

3,515

0,572

602,4

375,9

31 5, 5

5I 3

7,500

4, 110 з, 475

1, 202

553,!

347,3

403,8

88,6

Формула изобретения

Составитель В. Дамкин

Техред J1.Сердюкова Корректор О, Кравцова

Редактор Н. Козлова

Заказ 4363 Тираж 486 Подписное

ВИИИПИ Государственного комитета по изобретениям к открытиям при ГКНТ CCCP!!3035, Инск«а, Ж-35, Раушсквя наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, !О!

1 Таким образом, иэ табл. 1:, н:гдно, что предлагаемый способ езко выделяется по числу растений-регекер&нтов и позволяет полностью исклю кть обрастание выживших апексон калиусной тканью - все выжившие показывают прямую, регенерацию в растении: для сорта нДомодедовский" число вьгжившкх апексов 82Х и число растений-регенеран- 25 тов также 823. Характер развития апексов не оставляет сомнений н f рямой регенерации, что исключает необходи" мость в проведении сложной к трудоем" кой процедуры идентификацкк генотипа 30 полученньпг растений. Следовательно, предлагаемый способ, обеспечивающий высокий выход растений-регекерантон и экономию труда и средств, расходуемых нв поддержание лабсратор«ых л .полевых коллекций со15тов, форм и видов картофеля, пс сравнению с аналогами является существенно.менее трудоемким; так как пе требует викул сложной хонсТруКцки которую ягкходкт 40 ся изготовлять . и монтировать вручную и затем стерилизовать ам.-гули, позволяет .исключить он&рации :.кмк .еской стерилизации и последующей тре кратной промывки проростков клубней к по- „ лучать всегда заведомо вполне здоровый материал для размножения к селекции, исключив сезоннь|е перерывы в ра» боте к спасность инфицирования образцов поверхчостной микрофлорой клуб50 невых проростков.

Способ криосохранения генофонда сортов н видов картофеля, включающий предварительное культивирование апексон растений на питательной. среде,содсржащей микро- и мвкроэлементы по, прописи.Мур&сиге-Скуга, размещение кх,. ампулах, программное замораживание в упаковке в присутствии раствора кркокротектора с затравкой кристаллизации этдгс раствора и последующей стабилизацией температуры до момента распространения кристаллов по всему объему раствор&,,ранение при темпео ратуре ниже -140 С о т и и ч а юшийся тем, что, с Мелью повышения надежности крносбхранения, увеличения жизнеспособности апексов и нбсспеченкя генетической идентичности регенерированных растений, в: качестве исходного материала используют 26-28-дневные стерильные растения, выращиввемые в строго контролируемых условиях, в раствор крио«ротектора

1 допнлнительггн вводят сахврзэу в концен грации 5-!Ой, в питательную с! еду дополнительно вводят вделан в количестве 10-40 мг/л, витамины добавляют по прописи Стаба, а в качестве .упаковки для замораживания апексов используют пакет кэ фильтровальной бумаги, снабженный фитилем, по длине равным высоте ампулы.