Штамм культивируемых клеток кожи и мышц эмбриона человека для изготовления диагностических препаратов
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для вирусологических исследований и оценки антивирусного действия химиопрепаратов. Цель изобретения - получение нового штамма культивируемых диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемого для изготовления диагностических препаратов и размножения вирусов. Штамм получают трипеннизацией кожно-мышечных лоскутов 10-недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным условиям культивирования. Штамм обозначают М-23, он хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур Института медицинской генетики АМН СССР под номером Д-3 (15/2/7). Штамм способен к прививкам без снижения пролиферативной активности до 41 пассажа. Процент диплоидных клеток колеблется в пределах от 90,2 до 93,2, полиплоидных - от 0,6 до 1,9. Штамм обеспечивает накопление специфического антигена ИМВ в титре 1:32, используемого в РСК, и служит в качестве тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции. Штамм пригоден для накопления биомассы вируса полиомиелита.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
COUHAflHCTVHECHHX
РЕСПУБЛИК (50 4 С 12 N 5/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ABTOPCHOMY СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГННТ СССР (21) 4360224/30-13 (22) 07.01.88 (46) 30,10.89 ° Бюл. № 40 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (72) Л.Л. Миронова, Н.К. Преображенская, В.Н. Мартынова, Г.П. Крючкова, В.И. Стобецкий, В,Я. Кармьппева, С,И. Кудинова, В,Д. Попова и Г. А, Алпатова (53) 615.281.8.03(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 764391, кл. С 1? N 7/00, 1980.
Авторское свидетельство СССР № 1317021, кл. С 12 N S/00, 1987. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК КОЖИ И МЫШЦ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕС1ИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для вирусологических исследований и оценки антивирусного действия химиопрепаратов. Цель изобретения — получение
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для вирусологических исследований и оценки антивирусного действия химиопрепаратов.
Цель изобретения — получение нового штамма культивируемых диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемого для изготовления диагностических препаратов и размножения вирусов, „„SU„„1518370 А 1 нового штамма культивируемых диплоицных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемого для изготовления диагностических препаратов и размнокения вирусов. Штамм получают трипсинизацией кожно-мышечных лоскутов 10недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным условиям культивирования, Штамм обозначают М-23, он хранится но Всесоюзной специализированной коллекции клеточных к пьтур Института медицинской генетики ANH ГССР под номером Д-3 (15/2/7). Штамм способен к грививкам без снижения пролифвративной активно ти до 41 пассажа. Процент диплоидных клеток колеблется в пределах
90,2-93,2 ° полиппоидных — 0,6-1,9, Штамм обеспечивает накопление специфического антигена ИМВ в титре 1:32, используемого в РСК, и служит в качестве тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции. Штамм пригоден для накопления биомассы вируса полиомиелита.
Штамм получают счедуюцим образом.
Исходной тканью служат кожно-мышечные лоскуты )О-недельного эмбриона человека, выделенного путем аборта от здоровой женщины 30 лет, в анамнезе которой не было онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий, а также гепатита и туберкулеза.
Первичную культуру клеток эмбриона человека готовят с помощью метода
15 8370 щадящей трипсинизации измельченных кусгчков ткани 0,257-ным раствором трипгина при чередующихся контактах питательной средой.
Клети ресуспендируют н среде Игла
МР1 с 107. CKPС и эксплантируют 10 пол утор алитр овых матрас он с концентр аппей клеток 9 ° 0 /мл, Госуды с клетф камп инкубируют при 37 Г. В перничной культуре монослой формируется за 9 сут. Затем проводят первое субw".. Используют среду того же состава. Отдегенне клеток от стекг:а осуществля<от 0,257-ным раствором трипсина при кратковременном контакте их с 20 ферментом. Кратность рассева клеток ь фа з е активного роста с<." танля вт 2, l:3., llолученный штамм обозначаю г М- 23. Ш гамм М-23 хранится во Всесоюзной < пепиализированной коллекции кпеточ<и«< культур Института медицинской генетики АМН СССР под номером ДЗ (15/2/7). 1
Жизненный цикл штамма 55+3 пассажа <ь,<:и р<;<тз ..ачовление !†пас."5 саж„,",кчивиый пост 3-41, старение 4 58 пасeaжей.. "pa rI«« I paг<-ена в первых двух ""... а 1; 1, pже 1: 2, третьей — l: I, на уровнях по<педующих пасса3 жей 1:. 1, посевная доза 75-100 i l é н мл сpelfK Игла УМ с 10! СКРГ. 0-< .<елепие K 0,25:".-ни<<, зстз< ром трипсина. Количе< тно клез )I< в мопоспое 1,5-литрома I pace .$5 «5 мин. #тамг< об" адает высокой пр<лифератинной активностью и способен сохраняться на стекле в виде монослоя без смени среди не менее 2 нед. При криоконсервации применяют 807. среды Игла МЕМ, !O CKPC, в качестве криопротектора используют !О/ глицерина .pH концентрации клеток 2-3 ° 10 /мл. Жизнеспособными после восстановления остаютгя 75+57. клеток. Банк госенных клеток состоит иэ 200 ампчп, содержащих 0,7 млрд. клеток на уровне 7 пассажа, Изучение изоферментов F3 клетках штамма M-23 выявляет энзимограмму человека и глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназу медленного типа. Морфологические признаки. Первичная культура состоит из фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток с преобладанием первых. При вступлении культуры н фазу активного роста эпителиоподобные клетки исчезают и под малым увеличением микроскопа наблюдают мономорфную культуру с характерным для фибробластов ориентированным расположением клеток. Такой нид культура теряет в третьей фазе. Итамм М-23 изучают с помощью цитологических и цитохимпческих методов на уровне 11 и 25 пассажей. На фиксированных и окрашенных гематоксилHном и эозином препаратах установлено., что культура образует ровный монс-. слой, состоящий из веретеновидных однородных фибробластон, ориенгиронанных в потоки по длинной оси клеток, Ядра клеток удлиненнь|е, овальные, с од ержащи е 1-3 ядр ышк а и мелкие гль<бки хроматина. Вь сокая мит<,тическая активность наблюдается в пернь<е сутки после посадки, чо мере формирования монослоя количество делящихся клеток сн,гжается до единичных, -.то снидетельстнует о выраженной митотпческой, а акже KoIIтакт«ой HHI ибиции, Многс слойности куль-тури пе отмеч но, Кле тки штамма < нободны от онко-. гp-пной по<тенции, На гис1охимичегYHx Ilpellal.агах наблюдается обычное содержание 1!НК и РНК. Кислая и щелочная фосфотазы присутствуют н виде мелких глибок, редко разбросанных по цитоплазме. Гликоген обнаруживают также в виде мелких глыбок. Никаких признаков контаминации культуры (внутриядерных и цитоплазматических включений, вакуолизации, образование симпластов, патологических читоэов) не выявлено, Кариологическая характеристика, Кариологический анализ проводят на уровне 10, 20, 30, 40 пассажей по lOOO метафаэ, 2п 46. Процент диплоидных клеток колеблется .от 90,2 до 93,2, процент полиплоидных — от 0,6 до 1,9, Последний показатель на !,! ню«е допустимо! 51837>"> Пример 2, Кучьтуру клеток штамма M-23 на урог<не тридцатого пассажа готовят по спссобу, с..исаниому 55 в примере 1, клеточиую в в сь вносят в 1,5-литровые матра;ы, Кч,:тки ичкубис руют н термостате при 37 С н течение 3 сут до формирог>алия м нос.тоя, го В03 предела для диплоидных клеток человека, используемых для изготовления медицинских вирусных вакцин, в связи с этим штамм может быть применен в вакцинном производстве, Контроль штамма М-23 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма M-23 на стерильность (наличие грибов, бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровне 1-!О пассажей. При обследовании культуральной жидкости и самих клеток на уровне 10, 20, 30, 40 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакциях гемадсорбции вирусы контаминанты не выявлены. При обследовании штамма M-23 на уровнях 12, 21 31, 41 пассажей в опытах на взрослых и новорожденных мьппах, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах, иммунодепрессированных мышах линии СВА посторонних агентов, в том числе и онкогенных, не обнаружено. На фиксированных и окрашенных препаратах культуры штамма М-23 патологических измен .ний не ныявлено. Чувствительность к вирусам. Штамм М-23 чувствителен к попиои цитомегаловирусу. Вирусом полиомиелита заражают культуру на уровне 8, 9, 12 пассажей. Накопление вируса всех трех типов в высоких титрах зарегистрировано без адаптации, На уровне восьмого пассажа титр вируса I типа — 7,71; II — 7,64, III — 7,87. Аналогичные результаты для девятого пассажа — 7,62; 7,34; 7,96; для двенадцатого пассажа — 7,89; 7,70;. 7,55 1g БОЕ/мл. fITp штамма Ad-169 цитомегаловирусов колеблется от 10 до 10 ТЦЛ /мл. г 1 Штамм М-23 используют в качестве тест-системы для диагностики цитомегаловирусной инфекции, Пример 1. В культуральный сосуд со штаммом М-23 диплоидных клеток кожи и мьппц эмбриона человека на уровне двадцатого пассажа вводят смесь растворов 0,25 трипсина и 0,02, версена (1:5 ), подогретого до 37"С, Монослой ополаскивают и жидкость удаляют. Сосуд с культурой оставляют до отслоения клеток от стекла при 37 С. Затем в него вводят среду роста (г!гла MEM ) с 10% СКРС о концеитраги bl 2!3 !) "/мч Bчвесь и объеме 1 мл вносят и пробирки со стеклом, Кле-.ки инок ".èpóN; г >3 тор»о-. стате при 37 С в теч иие " ут дс формирования . .>»; чсчо». удаляют ростовую -реп и в четыре пробирки с кгчетками виоят пробы мочи больного с подочгвением на цито10 мегаловирусную инфекцию !чо 0,2 мл в каждую), Через 40 м«н после контакта культуры триждь> промивают питательной средой и добавляют поддерживающую среду. В течение 10 дней ! 5 культуру ежедневно микроскопируют. На седьмой день регистрируют специфические изменения клеток, выражакщиеся н их округлении и изменении структуры ядер. На восьмой день куль20 туры двух пробирок фиксируют и окрашивают для цитологическогo анализа, а . клетки двух других пробирок отделяют от стекла и взвешичают ;- 2 мл среды. Полученную клеточную взвесь вводят в четыре гробирки с монослойнои культурой штамма М-23, по 0,3 мп в каждую. Контакт с зараженными клетками продолжается 4>3 ми::., Вс . остальные процедуры проводя1 аналогично 30 описанному. ?!ля г»ьчелеиич вируса трегуется пять сокульт;вир.. в аии>3, На последнем пассаже »роизвод ;т сбор вирусосодержащей жид:ос ги, определяют титр вируса, идентифицируют свежеизолированиый штамм ЦМВ I! реакции не iгрализации со .пепифич> ской иммунНОЙ сывороткой попу ениой и!>и Гипеp иммунизации кроликов эт.->лонным штаммом Ad 169. Установленный птам>.. обо40 эиачают ЦМВ-493. Нз культуры пятого пассажа готовят циточогически> препараты, которые окрашивают гемагоксилином и эозином, При микроскопировании в них выявляют характерные для 45 ЦМВ виутриядерные вкчючеиия — > сoвигъп глаз". Аналогичный штамм ЦМВ-493 с помощью тех же процедур вь>челен из слюны 50 больного, который также идентифицирован как ЦМВ.! 5!8370 Среду роста из матраса удаляют и вносят штамм Ad-169 цитомегаловирусов в виде цельной нирусосодержащей жидкости н объеме 10 мп при титре 5 1g Т1Щ /мп. Контакт вируса с клетками — 1 ч при 37 С. Затем в каждый матрас нводят 100 мл поддерживающей среды и инкубируют при 37 С до момента равития цитопатических изменений н 80 клеток. Среду удаляют, клеточный слой однократно промывают питательной средой и добавляют 10 мл глицинового буфера, рН 9,5. Матрас с клетками помещают на 12 ч при 4 С, После этого взвесь клеток переносят в пробирку и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. В качестве антигена используют надосадочную жидкость. Проводят предварительно 20 тнтрование антигена с эталонной сывороткой в присутствии комплемента. Титр антигена 1:32. Основную реакцию станят с разведением 1:16. Пример. 3. Культуру клеток 25 штамма М-23 на уровне 27 пассажа готовят по способу, описанному в примере 1. Для оценки антивирусного действия ацикловира используют концентрации 30 0,25-250 мкг/мл. В пробирку с монослоем вносят по 0,1 мл неразведенного ЦМВ с титром 5 1g ТЦЛ,/мп, адсорбцию вируса осуществляют н течение 1 ч. Затем его 35 удаляют, культуру промывают питательной средой и вводят поддерживающую среду, содержащую ациклонир н указанных концентрациях. Учет результатов проводят ежеднев- 40 но в течение 13 сут. Ингибирующее действие препарата установлено с дозой 250 мкг/мл: специфическое поражение клеток в контроле отмечено на вторые сутки, с ацикловиром — на шес- 45 тые. В последующие дни цитопатические изменения нарастают и к тринадцатым суткам регистрируют поражение клеточного пласта, аналогичное контролю, На ocHGBBHHH полученных результа тов допустим, что ацикловир обладает ограниченной способностью подавлять репродукцию ЦМВ, Пример 4, В культуральньп! со55 мьппц эмбриона человека М-23 на уровне ? 1 пассажа вводят 0,25 .-ныи раствор трипсина, подогретого до 37 С. Через 5-7 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термастат при о 37 С на 2-3 мин.. Затем вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла. После этого в клеточную взвесь добавляют среду роста — Игла MEM — с !O СКРС вЂ” и разливают на два сосуда. Эти культуры двадцать вторбго пассажа инкубируют при 37 С в течение 3 сут до момента формирования плотного манослоя. Для заражения используют штамм ЦМВ-493 на уровне пятнадцатого пассажа с титром 4 1g ТЦД, /мл, На седьмые сутки 80-90 клеток подвергаются специфической дегенерации, и титр ЦМВ равен 6 1g ТЦЛ и/мл. Пример 5. Культуру клеток штамма М-?3 на уровне двенадцатого пассажа получают по способу, описанному в примере 4, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбина, тип I) из расчета 1 БОЕ на клетку. Культуру инкубируют при 34 С, Сбор вируса проводят на третьи сутки, Титр вируса в первичной культуре клеток почек африканских зеленых мартьппек равен 7,89 1g БОЕ/мп. Пример 6, Культуру клеток штамма М-23 на уровне двенадцатого пассажа получают по способу, описанному в примере 1, и заражают вирусом полиомиелита (штамм Сэбина тип II) по способу, описанному в примере 5. При этом титр вируса составляет 7,7 1g SOE/ìë. Пример 7. Культуру клеток штамма М-23 на уровне девятого пассажа получают по способу, описанному в примере, 1, и заражают вирусам по" лиомиелита (штамм Сэбина, тип Т.II) по способу, описанному в примере 5. При этом титр вируса составляет 7,96 1g БОЕ/мл. Формула изобретения Итамм культивируемых клеток кожи и мьппц эмбриона человека BCKK-Д ИД-3 (15/2/7) для изготовления диагностических препаратов.
