Рекомбинантная плазмидная днк рмм 9, кодирующая синтез белка a staphylococcus aureus, способ ее конструирования и штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент белка a staphylococcus aureus

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Целью изобретения является повышение уровня синтеза белка A St. aureus. Цель достигается за счет плазмиды pMM9, несущей ген белка A и стабильно поддерживающейся в различных грам-положительных микроорганизмах, способа получения этой плазмиды, включающего в качестве промежуточного этапа клонирование гена белка A в клетках E. coli, а также штамм B. subtilis IPM-12, секретирующего белок A во внеклеточную среду в количестве не менее, чем 100 мг/л культуральной среды. 3 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмиду, обуславливающую синтез белка А Staphylococcus aureus в клетках грамположительных бактерий. Целью объектов изобретения является повышение уровня синтеза белка А. Для достижения цели в клетки штаммов Bacillus spp. передают плазмиду рММ 9. Плазмида рММ 9, кодирующая белок А S.aureus и стабильно поддерживающаяся в клетках бацилл и других грамположительных бактерий (Staphylococcus spp.), состоит из следующих элементов 4,7 т.п.н. EcoRI, Pst I фрагмент ДНК плазмиды рРL 608 и структурной части (без промотора) гена хлорамфениколацетилтрансферазы из Bacillus pumilis; 2,0 т.п.н. EcoRI, Pst I фрагмента ДНК S.aureus CowanI, содержащего ген белка А с собственным промотором. Размеры плазмиды 6,7 т.п.н. Для конструирования плазмы рММ 9 используют способ, заключающийся в том, что смесь ДНК S. aureus CowanI и плазмиды pBR 327 подвергают гидролизу рестрикционной эндонуклеазой Pst I, образовавшиеся фрагменты соединяют ДНК-лигазой и трансформируют клетки Е. coli НВ 101, трансформанты высеивают на среду с тетрациклином, отбирают среди клонов с фенотипом TcRApS-клоны, продуцирующие белок А, из этих клонов выделяют плазмидную ДНК (плазмида рММ 38), смесь этой ДНК с ДНК рРL 608 расщепляют рестриктазами Pst I и EcoR I и после лигазной обработки фрагментов ДНК трансформируют клетки Bacillus subtilis или Bacillus megaterium, отбор трансформантов ведут по устойчивости к хлорамфениколу и по продукции белка А. Для достижения цели получен штамм В.subtilis IPM-12 трансформацией клеток B. subtilis ВО 224 плазмидой рММ 9. Продукция белка А этим штаммом на богатых средах составляет более 100 мг/л и превышает уровень синтеза этого белка штаммами S.aureus. Препараты белка А, получаемые при культивировании B. subtilis IPM-12, свободны от токсинов и могут широко использовать в медицинской практике. В отличие от S.aureus при работе с B.subtilis IPM-12 штаммом непатогенной бактерии не требуется специальный режим. Штамм B.subtilis IPМ-12 характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочкообразной формы, размером 0,7-0,8 х 2-3 мкм подвижные, грамположительные, спорообразующие, расположение спор центральное. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре и агаризованной среде LB-колонии круглые с ровным краем, могут диссоциировать на R- и S-формы. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, среде LB, образует ровную интенсивную муть. Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре в пределах от 5 до 50^оС, могут расти при рН 5,7 и 7%-ной концентрации NaCl. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит, цитрат. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде аминокислот и пептидов. Нитраты восстанавливают до нитритов. Гидролизуют крахмал. Расщепляют казеин. Не гидролизуют гиппурат. При росте на цитратно-солевом агаре образуют щелочь. Устойчивость к антибиотикам. Проявляет признаки устойчивости к канамицину и хлорамфениколу, обусловленные наличием плазмиды рММ 9. П р и м е р 1. Клетки E.coli К 802, содержащие плазмиду pBR 327, выращивают в 10 мл среды LB (триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 5 г, вода 1 л) до поздней логарифмической фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин 2^оС) и суспендируют в 0,1мл раствора: 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкозы, лизоцим 2 мг/мл, выдерживают 5 мин при 0-2^оС, прибавляют 0,2 мл раствора: 0,2N NaOH, 1%-ного додецилсульфата натрия и осторожно перемешивают. Затем в лизат вносят 0,15 мл 3М ацетата натрия, рН 4,8, перемешивают, выдерживают 1 ч при 2-4^оС и центрифугируют (3000 g, 5 мин, 2-4^оС). К супернатанту добавляют 1 объем этанола и выдерживают 2 ч при 0^оС. Осадок ДНК собирают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 2-4^оС), растворяют в 0,5 мл буфера ТЕ (10 мМ трис HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и осаждают добавлением 1,25 мл этанола. Осадок собирают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 2-4^оС) и растворяют в 0,2 буфере ТЕ. ДНК из клеток штамма S.aureus CowanI выделяют фенольным методом. Клетки выращивают в течение ночи при 37^оС в 1 л среды LB, собирают центрифугиpованием пpи 6000 g, 4^оС, 20 мин суспендируют в 10 мл 0,05 М трис HCl, рН 8,0, 0,05 М ЭДТА, 25% сахарозы и добавляют 1 мл раствора, содержащего литический фермент Sraphylococcus epidermis. Для получения этого раствора клетки S.epidermis PN 3239 выращивают в 200 мл среды LB в течение ночи, культуру центрифугируют, к супернанту добавляют (NH₄)₂SO₄ до 70%-ного насыщения, выпавшие белки отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 0,01 М трис HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и диализуют против этого буфера в течение ночи. Раствор литического фермента разливают в пробирки по 1 мл и хранят при -70^оС. Обработку клеток S.aureus литическим ферментом ведут в течение 2 ч при 37^оС. Затем к суспензии добавляют 0,05 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,05 мМ ЭДТА до конечного объема 50 мл, 2,5 мл 20%-ного додецилсульфата натрия и предварительно прогретую 30 мин при 37^оС протеиназу К до концентрации 100 мкг/мл и инкубируют 24 ч при комнатной температуре. Дальнейшую депротеинизацию проводят встряхиванием раствора с равным объемом свежеперегнанного фенола, насыщенного 0,05 М трис-NCl, рН 8,0, 0,05 ЭДТА, в течение 10 мин. Водную фазу отделяют центрифугированием (10 мин, 6000 g) и повторяют обработку. ДНК из водной фазы осаждают добавлением двух объемов этанола, осадок дважды промывают в 70%-ном спирте и растворяют в 5 мл ТЕ. Полученные препараты ДНК S.aureus CowanI и плазмиды pBR 327 используют для конструирования плазмиды рММ 38. Смесь этих ДНК (6 и 1 мкг соответственно) инкубируют с эндонуклеазой PSt I (8 ед) в буфере А, содержащем 10 мМ трис-HCl, pН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ 2 меркаптоэтанола. Через 2 ч инкубации при 37^оС реакцию останавливают прогреванием смеси при 65^оС в течение 10 мин. Анализ степени гидролиза ДНК проводят с помощью электрофореза в геле 0,8%-ной агарозы. Соединение Pst I фрагментов проводят в течение 16 ч при 6^оС в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитола и ДНК-лигазу фага Т4 (ед. фермента на 2 мкг ДНК). Полученную ДНК используют для трансформации клеток E.coli HB 101 (hsdS 20, (r_в^-, m_в^-), reсAl3, ara-14, proA₂(Smr). 0,1 мл ночной культуры E.coli HB 101 вносят в пробирку с 10 мл среды LB и выращивают до титра 1 ˙ 10⁸ кл/мл при 37^оС. После охлаждения на ледяной бане клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, 0^оС), суспендируют в 10 мМ холодного (0-2^оС) 0,1 М CaCl₂ и выдерживают 1 ч при 0^оС. Затем клетки снова осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл CaCl₂ и используют для трансформации. Для трансформации 0,2 мл суспензии обработанных СaCl₂ клеток HB 101 смешивают с 0,05 мл раствора ДНК, инкубируют 1 ч при 0^оС и затем 3 мин при 42^оС. Трансформированные клетки вносят в пробирку с 2 мл LB после инкубации при 37^оС в течение 2 ч высевают на агаризованную среду LB c 15 мкг/мл тетрациклина. Трансформанты, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирают по фенотипу Ар^sTc^R. Селекцию клонов, продуцирующих белок А, ведут по наличию линии преципитации в реакции иммунопреципитации (РИП) между лизатами клеток и сывороткой к белку А. Клетки трансформантов лизируют инкубацией в растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% триптона Х-100 и 0,1 мг/мл лизоцима. Препараты сыворотки к белку А получают из крови кроликов, иммунизированных этим белком. Из клеток Ap^STc^R клонов, синтезирующих белок А, выделяют плазмидную ДНК по методу, описанному выше. ДНК рекомбинатной плазмиды рММ 38, состоящей из генома pBR 327 и 3,2 т. п. н. Pst I фрагмента ДНК S.аureus CowanI, используют для конструирования плазмиды рММ 9. По 2 мкг ДНК плазмиды рММ 38 и плазмиды рРL 608 смешивают и расщепляют их рестриктазами Pst I и EcoRI. Гидролизат ДНК обрабатывают 1 ед ДНК-лигазы Т4, как было описано выше. Лигированную ДНК используют для трансформации компетентных клеток B.subtilis BD 224 trp. thr, recI-4). 0,5 мл ночной культуры BD 224, выращенной в среде Спицайзен [(NH₄)₂SO₄ 2 г, КР₂РО₄ 10 г, К₂HPO₄ 14 г, цитрат Na 1 г, MgSO₄ 0,2 г, глюкоза 5 г, дрожжевой экстракт 0,1 г, казаминовые кислоты 1 г, триптофан и треонин по 40 мг, вода 1 л] при 28^оС, добавляют в 10 мл той же среды и проводят инкубацию при 37^оС в течение 4 ч при постоянном встряхивании. Затем культуру разводят в 7 раз средой Спицайзен 11 [(NH₄)₂SO₄ 2 г, КН₂РО₄ 10 г, К₂НРО₄ 14 г, цитрат Na 1 г, глюкоза 5 г, MgSO₄ 1 г, казаминовые кислоты 0,5 г, вода 1 л] и выращивают в тех же условиях 90 мин. Для трансформации к 0,2 мл этой культуры добавляют 50 мкл раствора ДНК (1-5 мкг) и инкубируют в течение 30 мин при 37^оС. Добавляют 1 мл среды LB, растят 2 ч при 37^оС, а затем высевают на селективные среды. Клоны трансформантов отбирают на агаризованной среде LB, содержащей хлорамфеникол и канамицин (по 10 мкг/мл). Для определения продукции белка А рекомбинантными клонами в среду добавляют иммуноглобулины человека (1 мкг/мл). Из клеток клонов, образующих зону преципитации, выделяют плазмиду рММ 9. Величину продукции белка А штаммов IPM-12 определяют следующим образом, 1% -ный раствор агарозы в 0,075 М барбиталовом буфере, рН 8,6, при 48^оС смешивают с моноспецифической сывороткой к белку А до конечной концентрации последней 2% 19 мл смеси наносят на стеклянную пластинку 95 х 85 х 2 мм. После застывания агарозы в геле вырезают лунки диаметром 3 мм на расстоянии 12 мм друг от друга. Стекла помещают в Multifor-2117 (фирма IKB). В лунки геля вносят испытуемые образцы и проводят иммуноэлектрофорез в режиме: 20 в/см, 16-18 ч при 8^оС. После окончания иммуноэлектрофореза гель отмывают в физиологическом растворе в течение 2-3 дней, регулярно меняя раствор. Пластинку высушивают и окрашивают 0,01%-ным раствором Br.Blue Coomassie R-250. Количество белка А определяют, исходя из линейной зависимости размеров зоны преципитации от количества внесенного в лунку белка. Для построения градуировочной кривой в лунки вносили известные количества белка А (2; 5 и 10 мкг). В качестве экспериментального материала в лунки вносится культуральный фильтрат штамма IPM-12, выращенного в среде LB в течение 16 ч при 37^оС. При этих условиях продукция белка А штаммов IPM-12 составила 120 мг на литр среды. Стабильность поддержания плазмиды рММ 9 в бактериальных клетках определяют после выращивания культур в течение 100 генераций в неселективных условиях, рассева культур до отдельных колоний и анализа 500 клонов каждой культуры на маркеры этой плазмиды. Частота утраты штаммом B.subtilis IPM-12 плазмиды рММ 9 составляет не более 10^-4. П р и м е р 2. Трансформацию протопластов Bacillus megaterium штаммов КМ и 216 ДНКК рММ 9 проводят по методу Chang S. и Cohen S.W. (Mol. Gen. Genet, 1979, 168, 111-115). Колонии, формируемые регенерирующими протопластами, переносят на агаризованную среду LB и проверяют по устойчивости к антибиотикам (хлорамфениколу, и канамицину), а также по способности продуцировать белок А аналогично клонам B.Subtilis. При выделении ДНК из клеток B.megaterium, синтезирующих белок А по методу Birnboim H.C. и Doly, обнаруживается плазмидная ДНК, соответствующая рММ 9. Количество белка А, секретируемого клетками B. megaterium, несущими плазмиду рММ 9, определялось по методу, описанному в примере 1. Уровень продукции белка А при выращивании в среде LB при 37^оС в течение 16 ч равен 20-30 мг на литр среды. Таким образом, изобретение позволяет получать стабильные штаммы B.subtilis и других грамположительных бактерий, продуцирующие белок А. Уровень синтеза белка А в штамме IPM-12, содержащем плазмиду рММ 9, составляет свыше 100 мг секретируемого продукта на литр среды, что превышает продукцию этого белка в клетках S.aureus.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pMM 9, кодирующая синтез белка A Staphylococcus aureus, размером 6,7 т. п. н. содержащая: Pst I-EcoR I-фрагмент векторной плазмиды pPL 608 размером 4,7 т. п. н. EcoR I-Pst I-фрагмент хромосомы Staphylococcus aureus Cowani размером 2,0 т. п. н. несущий ген белка A с собственным промотором; cat-ген хлорамфениколацетилтрансферазы без промотора; Km^г-ген устойчивости к канамицину; уникальные сайты рестрикции EcoR I; Pst I; круг хозяев - грамположительные бактерии. 2. Способ конструирования плазмиды pMM 9, кодирующей белок A, заключающийся в том, что смесь ДНК Staphylococcus aureus Swant I и плазмиды pBR 327 гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой Pst I, фрагменты соединяют ДНК-лигазой, смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки Escherichia coli HB 101, отбирают клоны с фенотипом Ap^sTc^r, продуцирующие белок A, из них выделяют плазменную ДНК, содержащую полый ген белка A, полученную ДНК и ДНК плазмиды pPL 608 расщепляют рестриктазами Pst I и EcoR I, лигируют, трансформируют клетки B, subtilis, отбирают трансформанты, устойчивые к хлорамфениколу, продуцирующие белок A, из отобранных клонов выделяют плазмиду ДНК pMM 9. 3. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКМ CR-302 D продуцент белка A Staphylococcus aureus.