Способ детекции нуклеиновых кислот

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и медицины для нерадиоактивного лечения нуклеиновых кислот. Цель изобретения - упрощение и удешевление способа нерадиоактивного лечения и детекции нуклеиновых кислот. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве метки к нуклеиновой кислоте присоединяют гидразид общей формулы R - CO - NH - NH<SB POS="POST">2</SB>, где R : HH<SB POS="POST">2</SB>-NH-

NH<SB POS="POST">2</SB>-NH-CO-(CH<SB POS="POST">2</SB>)<SB POS="POST">N</SB>-

N<SB POS="POST">3</SB> - @ - и для детекции метки проводят обработку модифицированной нуклеиновой кислоты ферментом-гликопротеидом, предварительно окисленным перииодатом натрия с последующим определением образующегося продукта ферментативной реакции.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (5! ) 5 С O l N 33/58

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ и для детекции метки про (Х02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4387532/28-14 (22) 03.03,88 (46) 23.01,90,Бюл. Ф 3 (71) Институт медицинской генетики

AMH СССР (72) А.В,Карпухин, Н,Н,Вейко и Д.M.Спитковский (53) 612.015 (088.8) (56) Viscidi, RP et al., 3. Clin, .Microbiol, 1986, v.23,N - 2 .р.311-317. (54) СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ (57) Изобретение относится к молеку лярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и медицины для нерадиоактивного мечения нуклеиновых кислот.

Цель изобретения — упрощение и удеИзобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в других областях биологии и медицины для нерадиоактивного мечения и детекции нуклеиновых кислот.

Цель изобретения . — упрощение и удешевление способа нерадиоактивного мечения и детекции нуклеиновых кислот.

Цель достигается тем, что в качестве метки к нуклеиновой кислоте присоединяют гидразид и для ее де-текции проводят обработку модифицированной нуклеиновой кислоты ферментом-гликопротеидом, предварительно

„„SU„„538126 А1

2 шевление способа нерадиоактивного лечения и детекции нуклеиновых кислот.

Сущность изобретения состоит в том, что в качестве метки к нуклеиновой кислоте присоединяют гидразид общей формулы R — СΠ— NH — NH, где

R : NH -NH — ° NH -NH-C0-(СН )n- °

t 9 водят обработку модифицированной нуклеиновой кислоты ферментом-гликопротеидом, предварительно окисленным перииодатом натрия с последующим определением образующегося продукта ферментативной реакции. окисленным перииодатом натрия, либо проводят такую обработку ферментомгликопротеидом без предварительного окисления перииодатом натрия.

Способ осуществляют следующим образом, B качестве метки к нуклеиновой кислоте присоединяют молекулу, содержащую гидразид общей формулы

R — - СΠ— NH — ЯН де В. — ИН - NH-; яН -ИН-СО-(СН )„—;

15381 26

Для детекции метки проводят обработку нуклеиновой кислоты ферментом(М гликопротеидом, оксо-группы которого . ковалентно связываются гидразидными группами метки. При зтои для окисления гидроксильных групп фермент-гликопротеид предварительно обрабатывают перииодатом натрия, либо прн наличии оксо-групп в составе фермента такую обработку не проводят.

К пробам нуклеиновых кислот с иммобилизованным ферментом добавля, ют субстрат, проводят ферментативную

: реакцию и количество нуклеиновых кис лот определяют по интенсивности окра,шивания образовавшегося продукта.

Аналогичным образом определяют гомо,логичные нуклеиновые кислоты после их предварительной гибридизации с

1 меченой!. ферментом нуклеиновой кис: лотой, Пример 1. Введение гидразидl ной метки в нуклеиновую кислоту.

А. Включение по положению С-4 цитозина. 10 мкг денатурированной

ДНК растворяют в 50 мкл воды и добавляют 50 мкл водного раствора ди-! гидразида адипиновой кислоты (концентрация. 160 мг/мл) в смеси с бисульфитом натрия (380 мг/мл) или водного раствора карбазида (360 мг/

/мп) с бисульфитом натрия (380 мг/

/мл),Реакционную смесь инкубируют

2 ч при 37 С и проводят очистку с помощью гель-фильтрации на сефадексе

Q-25

Б. Включение с помощью фотореагента. 1О мкг ДНК растворяют в 50 мкл воды и добавляют 10 мкл 0,00! М раствора гидразида 4-азидо-2-нитробенэойной кислоты, Смесь облучают видимым светом в течение 30 мин и проводят гель-фильтрацию на сефадексе С-25.

Пример 2. ДНК, содержащую гидразидные группы и контрольную немеченую ДНК, наносят на нитроцеллю лозный фильтр в количестве lнг-lпг и

25 нг соответственно, Фильтры прогревают 2 ч при 80 С. Далее выдерживают в буфере А (О,ОIМ ацетат натрия, рН 4,3, О,l твин-20) в течение

20 мин и обрабатывают предварительно окисленной или неокисленной пероксидаэой в течение 10 мин в буфере А без твин-20 при комнатной температуре, Окисление пероксидаэы проводят обработкой периодатом натрия (4 мг/мч) в течение 5 мин, после чеro избыток реагента удаляют гельфильтрацией на сефадексе С-25, Фильтры отмывают буфером А 3 раза по

10 мин и затем добавляют смесь диаминобензидина (0,5 мг/мп) и перекиси водорода (О,ОЗХ) в 0 ° 1 М буфере трисНС1, рН 7,5. Инкубируют в течение

30-60 мин. Чувствительность определения ДНК меченой дигидразидом адипиновой кислоты составляет пг при отсутствии сигнала на контрольной немеченой, пробе, При использовании меченой гидра- зидом ДНК дпя гибридизации нитроцеллюлоэный фильтр с образцами ДНК, гомологичной меченой, нанесенной в ко.личестве 1-20 пг, и негомологичной

ДНК (25 пг) обрабатывают буфером

20 Б (0,6 М NaC1, 0,002 мг/ил поливинилпнроллидон, 0„07 М натрий-фосфатный буфер, рН 7ь5в 10 мкг/мл РНКэ50% формамид) в течение 1 ч при 37 С. Далее проводят гибридизацию в буфере Б, 25 содержащем ДНК, меченую гидразидом (пример IA) (100 нг/мн) при

37 С в течение 16 ч, Далее фильтр отмывают буфером В (0,07 М натрий-фосфат, 0,1 М NaC1, 0,5Х додецилсуль30 фат натрия, рН 7,5) при комнатной температуре 3 раза по 10 мин и буфером В, содержащим NaC1 в концентрации 0,05 М при 48 С в течение I ч, Затем фильтры выдерживают в буфере

А, содержащем 0,1 М NaC1, в течение

30 мин и обрабатывают ферментом, как описано выше,.Чувствительность определения составляет 20-50 пг при отсутствии сигнала на негомологичной

4Р ДНК

П р и и е р 3. Фильтры с нанесен. ной ДНК, содержащей гидраэидные группы (0,01 пг — 1 нг) и немеченой

ДНК вЂ” 50 нг, выдерживают в буфере

45 Г (0,1 М ацетат натрия, рН 5,2, 0,5Х твин-20) в течение I ч и обрабатывают предварительно окисленной

-галактоэидазой в течение 10 мин в буфере Г без твин-20 при комнатной температуре. Окисление галактозидаэы проводят обработкой периодатом натрия (4 мг/мл) в течение 5 мин в

О,I М натрий-фосфатнои буфере, рН 6,5; реакцию блокируют добавле55 нием глюкозы, Далее фермент очищают гель-фильтрацией. Фильтры отмывают буфером Д (0,1 М натрий-фосфат, рН 7,5) с добавлением 0,05 твин-20

2 раза по 5 мин и однократно буфе38126 6 ее проникновения к меченой нуклеино- вой кислоте, Это преимущество имеет наибольшее значение при использова" нии меченых нуклеиновых кислот для гибридизации insitu.

Чувствительность, обеспечиваемая предлагаемым способом, аналогична чувствительности при использовании .

10 в качестве метки биотина и конъюга-. та стрептавидин-пероксидаза для детекции.

Таким образом, предлагаемый способ уменьшает стоимость нерадиоактивного мечения и детекции нуклеиновых кислот и упрощает его, так как позволяет отказаться от использования молекул-посредников (биотина и авидина) и операций по их использованию. Кроме того, улучшает возможности детекции с помощью ферментов при нерадиоактивном мечении, что обусловлено уменьшением молекулярных масс и размеров метки на нуклеиновой кислоте и соединения-детектора.

Формул а и з о б р е т е н и я

Способ детекции нуклеиновых кислот, включающий введение метки в нуклеиновую кислоту, последующую обработку ее ферментом и определение количества образующегося продукта ферментативной реакции, о т л и—

35 ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и удешевления способа, в качестве метки используют гидразид общей формулы

R-СО-11Н-МН,, 45 х з "Я

NO2 урат

Корректор Т.Малец

15 ром Д (5 мин). Добавляют смесь 5-бро" мо 4-хлор-3-индолил-галактозид (0,3 мг/мй) и нитротетразолевый синий (0,4 мг/мп) в буфере Д, Инкуби" руют 2-4 ч, Чувствительность определения меченой ДНК составляет 0,1 .пг при отсутствии сигнала на контрольной пробе (50 нг).

Выбор фермента-гликопротеида при использовании способа определяется особенностями решаемых задач и может быть связан с такими характеристиками ферментов, как стоимость, стабильность, размеры, необходимые и доступные субстраты и т,д., а также необходимый и обеспечиваемый уровень чувствительности.

Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве метки нуклеиновой кислоты молекулу меньшую, чем биотин примерно в 8 раз. Поскольку гидразид может быть присоединен к нуклеиновой кислоте теми же способами, что и биотин, это уменьшает загрузку меченой нуклеиновой кислоты и, следовательно, изменение ее свойств, а также существенно удешевляет способ.

Например, стоимость эквивалентных количеств реагентов при мечении нук» леиновых кислот по положению С-4 цитозина с использованием в качестве метки гидразида уменьшается более чем в 100 раз по сравнению с мечением биотином (каталог фирмы Sigma, США, 1987, сравниваются дигидразид адипиновой кислоты и гидразид биотина). Эффект достигается и вследствие отказа от необходимости использования комплекса стрептавидинфермент. Так, стоимость конъюгата стрептавидин-пероксидаза и пероксидазы при одинаковой активности соотносятся как 20:1 (каталог фирмы

Sigma, США, 1987). Присоединение стрептавидина к пероксидазе увеличивает молекулярную массу молекулыдетектора в 2,5 раза. Следовательно, в предлагаемом способе молекула-детектор имеет меньшие размеры, что обеспечивает улучшение возможности

Составитель А.Ск

Редактор Н,Тупица Техред M.Ходанич где R-ИН -NH-; МН -NH-СО-(СН )„; а обработку проводят ферментом — гликопротеидом, Заказ 167 Тираж 501 Подписное

ВНННпН Государственного комитета по изобретениям и открытиям при Гкнт СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издатель. кий комбинат "Патент", г.ужгород, ул . Гагарина, 101