Способ определения эмбриотропного действия микробных препаратов

 

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель изобретения - ускорение и повышение точности способа. Проводят исследование содержания розеткообразующих клеток селезенки плода с препаратом "Зимозан-комплемент", определяют содержание ДНК в тимусе плода. Эмбриотропное действие определяют по снижению розеткообразования клеток селезенки плода с препаратом "Зимозан-комплемент" с одновременным снижением содержания ДНК в тимусе. Использование изобретения позволит выявить эмбриотропное действие микробных препаратов на уровне пороговых концентраций.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (gI)g G О1 N 33/49

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР р

«a 33HX- 5 з

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ОПРГДЕЛЕНИЯ ЭМБРИОТРОПНОГО ДЕИСТВИЛ МИКРОБ1Ь!Х .ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель ли одновременно.

Способ осуществляется следующиМ образом.

Беременных самок белых беспородных крыс подвергают ингаляциоыному воздействию микробного препарата, например энтоморфпна, в концентрациях

1 (21) 4422261/28-14 (22) 24.05.88 (46) 30.04.90. Бюл. Р 16 (71) Рижский медицинский институт (72) Л.Н.Калинина, И.М.Ремез, Х.М.Векслер и И.Е.Иващенко (53) 576.8.093.1 (088.8) (56) Методические рекомендации по

Г, токсикометрии. N. Секретариат СЭВ, 1687, с. 122-150.

Изобретение относится к области медицины, а именно к токсикологии.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Для осуществления способа необходимо соблюдать ряд условий.

Необходимо испольэовать взвесь . клеток селезенки, поскольку клетки тимуса в реакции розеткбобразования с препаратом зимоэан-комплемент дают низкие показатели розеткообразования в опыте и контроле, что не позволяет выявить достоверных отличий контрольной группы эмбрионов от опытной.

Необходимо использовать в реакции розеткообразования реактив "зимозанкомплемент", поскольку при проведении реакции с другими адекьатными маркерами, например аутоэритропитами, был отмечен лиэис маркерных клеток.

„„SU„„1561036 А 1

- 2 изобретения ускорение и повышение точности способа. Проводят исследование содержания роз еткообразующих клеток селезенки плода с препаратом

"зимозан-комплемент, определяют содержание JIFIK в тимусе плода. Эмбриотропное действие определяют по снижению розеткообразования клеток селезенки плода с препаратом "зимаэан-комплемент" с одновременным снижением содержания ДНК в тимусе. Использование изобретения позволит выявить змбриотропное действие микробных препаратов на уровне пороговых концентраций.

Определение ДНК необходимо проводить в тимусе, поскольку это один из самых крупных по величине из числа всех иммунокомпетентных органов, легко доступен для выделения °

Учет снижения роэеткообразования н клеток селезенки с реактивом эимозан-комплемент" необходимо проводить при наличии разницы с контролем на

ЗОБ и более при обязательном снижении содержания JJHK в тимусе на 407. и более, поскольку при наличии эмбриотропного эАфекта микробного препарата обязательно изменяются оба покаэате1561036

1,0 + 0,21; 4эО + 0,36;,8,0 + 0,35;

20,0 + 1,58 мг/м, производят кесарево сечение на 21-й день беременнос1и с соблюдением правила.поочередного вскрытия животных из разных групп, Селезенку продавливают через капроновую сетку с отверстиями 60 мк н пробирку, в которую затем добавляют

0,3 мл забуференного физиологического раствора. Доводят концентрацию взвеси клеток до 2 10 кл/мл. К 0,1 мл б акой взвеси клеток селезенки добавляют 0,1 мл 0,27 взвеси реактива

"зимозан-комплемент" на забуференном изиологическом растворе. Зимозаномплемент" готовят ех tempore путем оединения жидкого комплемента морсой свинки с зимозановыми зернами

-о течение 30 мин при 37 С. Взвесь

1 леток с зимозан-комплементом о нкубируют в термостате при 37 С в ечение 10 мин, затем пробирку цент ифугируют 5 мин при 100 g, Далее о йнкубируют взвесь при 4 С 60 мин.

Затем клетки взвеси фиксируют 0,1 мл

6,6 глютарового альдегида. Через

$ мин взвесь промывают забуференным физиологическим раствором и делают тонкие мазки на обезжиренных предметных стеклах, Иазки высушивают на

Воздухе, фиксируют 3 мин метанолом, Красят азур-эозином в течение 10 мин.

Оценивают процент розеткообразующих лимфоцитон от общего числа мононуклеарон, подсчитав 200 клеток. Находят процент снижения розеткообразующих лимфоцитов в опыте по сравнению с контролем, принимая контроль за

100 7..

Для определения содержания ДНК тимусы гомогенизируют при 4 С, осаж0 дают нуклеиновые кислоты из гомоГенатов НС10 при 4 С, осадок центрифугируют при 4 С при 4000-5000 g

10 мин; Охлаждение необходимо для йредотвращения энзиматической и киспотной деструкции нуклеиновых кислот.

Осадок отмывают НС10, спиртом, смесью спирта с эфиром для удаления кислоты, липидов, пигментов. ДНК выделяют в виде осадка при гидролиэе смеси нуклеиновых кислот NaOEI.

Выдерживают 1 ч на водяной бане при

80 С, охлаждают, нейтрализуют при

4 С НС10 .. Осадок ДНК отделяют на центрифуге с охлаждением в течение

10 мин при 3000g и гидролизуют НС1 в течение 1 ч при 100 С, В гидроли,затах определяют оптическую плотность при 270, 290 нм. По данным спектрофотометрических измерений проводят расчет содержания ДНК по формуле:

С мкг ДНК = 0 — — 10 3

Л %70 ЛЯ90

0,19 где 0,19 — поглощение 1 мкг фосфора нуклеиновых кислот, содерщихся н 1 мл раствора;

10,3 — средний пересчетный коэффициент для пересчета ко15 личества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот.

Находят процент снижения ДНК н тимусе эмбрионов н опыте по сравнению с контролем, принимая контроль за

100 7,.

При наличии разницы розеткообразо- . вания н селезенке на ЗОХ и более и содержания ДНК в тимусе íà 40Х и более у эмбрионон экспериментальных групп по сравнению с эмбрионами контрольных крыс определяем эмбриотропное действие.

Пример. При ингаляционном воздействии энтомофторина в концентрации 4,0 + 0,36 мг/м на беременных самок средний показатель розеткообразования клеток селезенки эмбрионов с препаратом "зимозан-комплемент" составляет 20,6 + 1,347, средний показатель содержания ДНК н тимусе

7,92 + 0,34 мг/г свежей ткани. У контрольной группы эмбрионов средний показатель содержания розеткообразую40 щих клеток селезенки с препаратом

"зимозан-комплемент" 29,44 «+ 1,347., средний показатель содержания ДНК в тимусе 13,2 + 0,6 мг/г свежей ткани. Показатель содержания розетко45 образующих клеток еелезенки у контрольных эмбрионов принимают за 100Х разница, между опытом и контролем .

29,44 — 20,6 = 8,84, что в процентах от контроля ЗО,ОХ. Показатель содержания gHR B тимусе KOBTpoJIbHblx эмбрионов принимают за 1007., разница между опытом и контролем 13,2—

7,92 = 5,28 мг/г, что в процентах от контроля — 40,0Х.

Проведено исследование 140 эмбрио55 нов при оценке эмбриотропного действия 3 микробных препаратов ° Подтверж дением эмбриотропного действия явились: снижение розеткообразования

Составитель E.ßðíûõ

Техред M.дидык

Корректор Л.Патай

Редактор 0.Спесивых

Заказ 976

Тираж 508

Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г . Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 15610 в селезенке на 301 и более и содержания ДНК в тимусе на 407. и более в экспериментальных группах эмбрионов крыс, подвергавшихся в период бере менности воздействию микробного препарата на уровне пороговой концентрации, по сравнению с параллельным контролем.

Использование изобретения позволит достоверно и объективно выявить эмбриотропное действие микробных препаратов на уровне пороговых концент— раций в течение двух дней исследования, в то время как известный способ 1 требует изучения 76 показателей в постнатальном периоде развития потомства в динамике до двухмесячного возраста.

36 6

Формула изобретения

Способ определения эмбриотропного действия микробных препаратов путем затравки крыс в. период беременности с последующим извлечением живого плода на 21 день беременности, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, исследуют розеткообразующие клетки селезенки плода с препаратом

"эимоэан-комплемент", затем определяют содержание ДНК в тимусе плода и при уменьшении розеткообразующих клеток селезенки на 307 и более и с одновременным уменьшением содержания

ДНК в тимусе на 402 и более определяют эмбрнотропное действие.