Способ получения иммобилизованной микробной инвертазы для гидролиза сахарозы

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов для гидролиза сахарозных сиропов, и может быть использовано в пищевой промышленности. Цель изобретения - увеличение выхода иммобилизованной инвертазы и повышение ее термостабильности. Способ заключается в ступенчатом связывании инвертазы на кремнеземных сорбентах, модифицированных органосиланом и активированных глутаровым альдегидом, в присутствии 50-70%-ного раствора сахарозы при 40-60°С, а также в проведении дополнительной обработки глутаровым альдегидом после связывания последней порции инвертазы. Способ позволяет увеличить выход иммобилизованной инвертазы от 38-39 до 47-72%, а также повысить термостабильность иммобилизованного фермента на 20-39%. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

СО}ОЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 С 12 N 11/00, )1/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫ7ИЯ}4

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4434458/30-13 (22) 30.05.88 (46) 15.05.90 ° Бюл. № 18 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) О.Н. Соседов, И.Д. Стальная и Л.А. Нахапетян (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР . ¹ 744002, кл. С 12 N 11/14, 1977, Патент Канады № 1143308, кл, С 12 N 11/00, опублик. 1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МИКРОБНОЙ ИНВЕРТАЗЫ ДЛЯ ГИДРОЛИЗА САХАРОЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов для гидролиэа сахароэных сиропов, и

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммобилизованных ферментов для гидролиза сахарных сиропов, и может быть использовано в пищевой промышленности.

Целью изобретения является увеличение выхода иммобилизованной инвертазы и повышение ее термостабильности.

Способ заключается в следующем, Иммобилизацию инвертазы проводят на кремнеземе, модифицированном аминопропилтриэтоксисиланом, активированном глутаровым апьдегидом и помещенном в термостатированный реактор колонного типа в водном растворе саха

/ розы с концентрацией 50-70K при 40„.Я0„„1564186 А1

2 может быть использовано в пищевой промьппленности. Цель изобретения увеличение выхода иммобилиэованной инвертазы и повышение ее термостабильности. Способ заключается в ступенчатом связывании инвертазы на кремнеземных сорбентах, модифицированных органосиланом и активированных глутаровым альдегидом, в присутствии 50-702-ного раствора сахарозы при 40-60 С, а также в проведении дополнительной обработки глутаровым альдегидом после связывания последней порции инвертазы. Способ позволяет увеличить выход иммобилизованной инвертаэы от 38-39 до 47-72Х а также повысить термостабильность иммо- Е билизованного фермента на 20-39Х.

1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1@ и

60 С. Затем реактор промывают водой и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида при температуре

15-250С для активации и стабилизации поверхности иммобилизованного фермента. Полученный препарат промывают водой и на него наносят следующий слой инвертазы в высококонцентрированном водном растворе сахарозы в тех же условиях, что и первый. Потом препарат снова активируют и стабилизируют глутаровым альдегидом в тех же условиях, что и предыдущий. Таким образом, получают многослойный препарат иммобилизованной инвертаэы с требуемой активностью. Затем в том же реакторе, где проводилась иммоби—

1564186

Лизация-,инвертазы, проводится непрерывный гидролиз сахарных сиропов с той же концентрацией (50-70 ) при той же температуре (40-60 С), причем сахарные сиропы подаются в реактор с противоположным направлением движения жидкости по сравнению с проведением процесса иммобилизации. После снижения скорости гидролиза опять проводится процесс активации иммоби тнзованной инвертазы глутаровым аль дегидом в тех же условиях с последующей иммобилизацией нового слоя инвертазы и ее стабилизацией глутаро-, вым альдегидом, аналогично описанному вьппе. Этот процесс повторяют до тех пор, пока активность иммобилизованной инвертазы не достигнет требуемого уровня. Процесс иммобилизации и активации иммобилизованного фермента проводят с противоположным направлением движения жидкости по сравнению с процессом гидролиза, После этого для проведения процесса гид- 25 ролиза сахарозы опять меняют направление потока жидкости и т.д.

Проведение процесса иммобилизации инвертазы в вь|сококонцентрированном растворе сахарозы при повышенной температуре (условия процесса гидролиза сахарозы ) позволяет химически зафиксировать фермент в акти,вированном состоянии, что существенно повьппает его активность и термо35 стабильность.

Применение предложенного способа позволяет увеличить выход иммобилизованной инвертазы от 38-39 до 4772, а также повысить термостабиль- 40 ность иммобилизованного фермента на

20-39 .

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е P 1. К 10 г силохрома 45

С-80 добавляют 25 мл 5 -ного водного раствора у-аминопропилтриэтоксисилана, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем избыток жидкости сливают, а силоь 50 хром прогревают при 120 С в течение

8 ч. Полученный модифицированный силохром промывают водой до исчезновения остатков силана и высушивают при 60 С. Содержание аминогрупп—

0 37 мг экв/г носителя. 1 r сухого

Э ! модифицированного силохрома помещают в стеклянную термостатированную ко= лонку, соединенную с перистальтическим насосом. Через колонку в.течение

1 ч прокачивают 10 мл 2,5%-ного (0,25 мл/г носителя) водного раствора глутарового альцегида при 20 С.

В течение всего процесса иммобили" зации подача жидкости в колонку осуществляется сверху вниз со скоростью

5 мл/мин., Избыток глутарового альдегида отмывают водой. В качестве фермента используют грибную инвертаэу инвертаваморин П10х с активностью

4000 ед./r. Через колонку в течение

2 ч пропускают раствор, состоящий из 1 мл водного раствора грибной инвертазы с активностью 450 ед./мл и 10 мл 67 .-ного раствора сахарозы в воде, при 60 С. Полученный препарат промывают водой. Активность иммобилизованной грибной инвертазы составляет 302 ед./r носителя (67 от исходной активности фермента, взятого для иммобилизации), С целью активации поверхности иммобилиэованного фермента и повышения его стабильности через колонку пропускают в течение 30 мин при 20 С 10 мл

2i5/-ного водного раствора глутарового альдегида (0,25 r/ã носителя), На этой стадии заканчивается получение однослойной иммобилизованной инвертазы. После промывки водой активность однослойного активироваиного и стабилизированного фермента составляет 324 ед./r носителя (72% от активности исходного фермента).

Для нанесения второго слоя инвертазы через колонку с препаратом снова пропускают раствор, состоящий из 1 мл грибной инвертазы с активностью 450 ед./мл и 10 мл 67%-ного раствора сахарозы в воде, в течение

2 ч при 60 С. Полученный препарат промывают водой, активируют и стабилизируют его поверхность пропусканием через колонку 10 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида (0,25 r/r носителя) в течение

30 мин при 20 С. Активность двухслойной иммобилиэованной инвертазы составляет 584 ед./г носителя (58 от активности фермента, взятого для получения второго слоя иммобилизованного фермента).

В тех же условиях проводят иммобилизацию третьего и четвертого слоев инвертаэы. Активность трехслойного фермента 813, четырехслойного—

1025 ед./г,.что составляет соответ5 15 ственно 51 и 477. от активности фермента, взятого для получения каждого из слоев, или 577 от общей активности инвертазы, пошедшей íà все четыре слоя иммобилиэованного фермента, После тщательной промывки водой колонка с многослойной иммобилизованной инвертазой готова для про ведения процесса гидролиза сахарозы.

Пример 2. Используют иммобилизованный фермент, полученный в примере 1. Процесс гидролиза сахарозы проводится в той же колонке

1 что v. процесс иммобилизации, однако сахарный сироп подается в колонку не сверху вниз, а снизу вверх. Процесс гидролиза сахароэы проводится в тех же условиях, что и процесс о иммобилизации: при 60 С и концентрации сахарозы 677. Скорость подачи сиропа, необходимая для 1007.-ного гидролиэа сахароэы,3 мл/ч. После того, как скорость подачи сиропа, необходимая для достижения 1007-ного гидролиэа, снижается до 2,1 мл/ч, проводится процесс восстановления активности колонки. Для этого колонка с иммобилиэованным ферментом опять промывается водой, причем направление потока жицкости меняется на подачу рас" âîðîâ сверху вниз. Активность иммобилиэованного фермента составляет 724 ед./r В условиях примера 1 проводят повторную активацию четырехслойной иммобилизованной инвертаэы водным растворам глутарового альдегида и иммобилизацию пятого и шестого слоев фермента. Ак-.. тивность пятислойной иммобилиэованной инвертаэы 950, шестислойной

1097 ед./г. После достижения требуемого уровня активности направление потока жидкости опять меняется на противоположное, а на колонке в тех же условиях проводится гидролиз сахароэы.

Пример 3. Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный по примеру 1. Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиэ сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2.

Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированно- го силохрома, соединенной с перисталь-. тнческим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы64186 6 равно 5. Активность фепмента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилиэованной инвертаэы,450 ед.

Скорость подачи растворов в процессе

5 иммобилизации 3 мл/ ин, поток жидкостч направлен с.:;.эу вверх. Время процесса иммобилизации на каждой стадии 3 ч, температура 40 С, концентрация сахарного сиропа 50ь . Время обработки глутаровы" альдегидом цля активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 1 ч,, темперао тура !5 С, концентрация 1,5 г/г носителя (15Е-ный водный РаствоР, . Активность однослойной грибной инвертазы 308, двухслойной — 556, трехслойной — 747, четырехслойной-972 и пятислойной — 1i "Ü ед,/г носи20 теля, что составляет 537 от общей активности фермента„ прошедшего на все пять слоев иммобилиэованной грибной инвертазы.

Процесс гидролиза сзхароэы про25 водится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации — при 40 С и кон— центрации сахарозы 507:, Подач"= жидко ти в колонку осуществляется сверху вниз, скорость подачи сиропа, не30 эбходимая для 1003-ного гидролиэа сахароэы, 3,2 мл/ч. После того, как скорость .подачи сиропа, необходимая для достижения 100 -ного гидролиза, сния<ается до 2,5 мл/ч, проводится

3 5 и р о, с с в о с с а н о в л е и я а к и в н о с иммабилизованного фермента в тех же условиях, что и процесс иммобилиза-. ции (аналогично примеру 2) ° В резуль= тате число слоев иммобилизованной

40 инвертаэы увеличивается с 5 до 6, а активность с 938 до 1140 ед./r носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гндролиза сахароэы в тех же условиях.

Пример 4. Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный по примеру 1. Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабили5Q зацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2.

Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированно. го силохрома, соединенной с перистальтнческим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 4. Активность фермента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед.

156 86

Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 4 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз, Время процесса иммобилизации на каждой стадии

0,5 ч, температура 60 С, концентрация сахарного сиропа 70%. Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 0,5 ч, температура 25 С, концентрация 0,05 г/г носителя (0,5%-ный водный раствор).

Активность однослойной грибной.инвертазы 318, двухслойной — 562, трехслойной — 752 H четырехслойной—

954 ед./r носителя, что составляет

53% от общей активности фермента, пошедшего на все четыре слоя иммобилизованной грибной инвepтазы.

Процесс гидролиза еахарозы проводится в тех же условиях, что и о процесс иммобилизации: при 60 С и концентрации сахарозы 70%. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, 25 необходимая до 100%-ного гидролиза сахарозы, 2,8 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до

1,9 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2), В результате число слоев иммобилизованной инвертазь1 увеличивается с 4 до 6, а активность — с

647 до 921 ед./r носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях, Пример 5. Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный в примере 1. Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2.

Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силохрома, соединенной с перистальтическим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 3. Активность фермента-, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед.

Скорость подачи. растворов в процессе иммобилизации 2 мл/мин, поток жид= кости направлен сверху вниз. Время процесса иммобилизации на каждой стадии 5 ч, температура 70 С, коне центрация сахарного сиропа 8ь%. Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 2 ч, температура 25 С, концентрация 2 г/r носителя (20%-ный Водный раствор), >

Активность однослойной грибной инвертазы 144, двухслоинои — 272, трехслойной — 356 ед./г носителя, что составляет 26% от общей активности фермента, пошедшего на все три слоя иммобилизованной грибной инвертазы.

Низкая активность иммобилизопанного фермента объясняется термоинактивацией грибной инвертазы в ходе процесса иммобилизации, которую не предотвращает даже высокая конце IT рация субстрата, а также инактивирующим действием высокой концентрации бифункционального реагента — глутарового альдегида.

Процесс гидролиза сахарозы прово-. дится в тех же условиях„, что и процесс иммобилизации: при 70 С и концентрации сахарозы 70%,, Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая,цля 100%-ного гидролиза сахарозы, 1,1 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до

0,7 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2). В результате число слоев иммобилизованной инвертазы увеличивается с 3 до 4, а активность — с

227 до 332 ед„/г носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условияхв

TT р и м е р 6 ° Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученнь по примеру 1, Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично .примерам 1 и 2.

Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силохрома, соединенной с перистальтическим насосом, Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 3. Активность фермента, добавляемого для получения кажрогп слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед. Скорость подачи растводобавляемого для полученн"..-:,ì÷oïëí. :-ванногG фермента, 3780 ед. Скзрост; подачи растворов в процессе иммобилизации 5 мл/мин, поток жидкости направлен снизу ннерх. Время процесса иммобилизации 2 ч, температура 45 С, концентрация сахарного сиропа 55Х, Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии

30 мин, температура 15 С, концентрация 0,30 мг/г носителя (ЭХ-ный водный раствор ). Активность однослойной дрожжевой инвертазы 2020 ед./г носителя, что составляет 53Х от активности фермента,, пошедшего на иммобилизацию.

Процесс гидролиза сахароэы проводится в тех же условиях, что и про o цесс иммобилизации: при 45 С и концентрации сахарозы 55Х. Подача жидкости в колонну осуществляется сверху вниз, скорость подачи сиропа, необходимая для 1007-ного гидролиза сахарозы, 6 мл/ч. После снижения скорости 100Х-ного гидролиза до 4 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной иннертазы в тех же условиях, что и процесс ию.обилизации (аналогично примеру 2,1.

В результате число слоев иммобилизо-:ванной инвертазы увеличивается с

1 по 2, а активность - с 1350 до

3260 ед./г носителя, Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях со скоростью 9,5 мл/ч. После снижения ско-. рости 1007-ного гидролиза до 7 мл/ч опять проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, в результате чего число слоев увеличивается до 3, а активность меняется с

2400 до 4360 ед./г носителя, после чего на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы.

П р и и е р 8. Для иммобилизации используют модифицированный силикагель, полученный по примеру 7. Активацию силикагеля, иммобилизацию слоев инвертазы, их активацию и стабилизацию и гидролиз сахарных сиропон проводят аналогично примерам 1 и 2.

Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированно го силикагеля, соединенной с перис.тальтическим насосом. Препарат состоит из 4 слоев иммобилизованных ин9 1564186 lO рон в процессе иммобилизации 5 мл/мин„ поток жидкости направлен сверху вниз.

Время процесса иммобилизации на каждой стадии 45 мин, температура 30 С, концентрация сахарного сиропа 40Х.

Время обработки глутаровым альдегидом дпя активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии

45 мин температура 25 С концентраt

10 ция 0,025 r/r носителя (0,25Х-ный водный раствор). Активность однослойной грибной инвертазы 165, двухслойной — 282, трехслойной — 392 ед./г носителя, что составляет 197. от общей активности фермента, поп едшего на нсе три слоя иммобилизованной грибной инвертазы, Низкая активность иммобилизованного фермента объясняется низкой кон- 2р центрацией глутароного альдегида и высокой вязкостью сахарозы при 30 С.

Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс .о иммобилизации: при 30 С и концентрации сахарозы 407,. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая для 1007-ного гидролиза сахарозы, 0,7 мл/ч. После снижения скорости

100 -ного гидролиза до 0,5 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру

2). В результате число слоев иммоби35 лизованной инвертазы увеличивается с 3 до 4, а активность с 280 до

365 ед./г носителя. Затем на колон-. ке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях.

Пример 7. Для иммобилизации используют модифицированный силикагель МСА-750, полученный по методике примера 1. Количество амино- 45 групп 0,32 мг-экв/г носителя. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силикагеля, соединенной с перистальтическим насосом. В качестве фермен- 5ц та использовали дрожжевую инвертазу марки А /Олайне/ с активностью

100000 ед./r. Активацию силикагеля, иммобилизацию слоев дрожжевой инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят. аналогично примерам 1 и 2. Число сло- . ев иммобилизованной дрожжевой инвертазы равно 1. Активность фермента, 11 ! 56418 вертаз. Б первом и третьем слоях находится дрожжевая инвертаза, во втором и четвертом - грибная инвертаза.

Активность фермента., добавляемогс для получения слоя дрожжевой инвертазы, 3780 ед, для получения слоя грибной инвертазы — 450 ед. Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 3 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз, Время процесса иммобилизации на каждой стадии

2 ч, температура 50 С, концентрас ция сахарного сиропа 67%. Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и r.òàáèëèýàöèè препарата на каждой стадии 30 мин, тем- пература 20 С,концентрация 0,2 г/г носителя (2%-ный водный раствор).

Активность однослойной иммобилизо-, 20 ванной инвертазы 2180, двухслойной

2460, трехслойной — 4380, четырехслойной — 4630 ед./г носителя, что составляет 55% от общей активности фермента, пошедшего на все четыре слоя иммобилизованного фермента.

Процесс гидролизa сахарозы проводится в тех же условиях, что и проо цесс иммобилиэаци. . при 50 С и концентрации сахарозы 67%. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза сахарозы, 13,5 мл/ч. После снижения ско35 рости 160%-ного гидролиза до 8,0 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инверта.—

12

Таким образом, использова. ;ие предложенного изобретения позволяет значительно увеличить выход иммобилизованной инвертазы (с 38-39% до 4772%?, а. также повысить термостабильность иммобилизованного фермента на

20-39%.

Ф о р и ул а и з о б в е т е н я

1. Способ получения иммобилиз. ванной микробной инвертазы для гидролиза сахарозы, включающий модификацию кремнеземных, сорбентов органосила° ./

:-;ом. активацию сорб ентов глутаровым ,. чьдегидом, связывание первой пор;„ии инвертаэы с активированными сор бентами, активацию иммобилизованной инвертазы глутаровым альдегидом, связывание второй порции инвертазы и многократное повторение активации глутаровым альдегидом и связывания следующих порций инвертазы, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода иммобилизованной инвертазы и повышения ее термостабильности, связывание инвертазы проводят при 40-60 С в присутствии 5070%-ного раствора сахарозы, а после связывания последней порции инвертазы проводят дополнительную обработку глутаровым альдегидом.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что связывание инвертазы сорбентом проводят в том же реакторе, в котором осуществляют гидролиэ сахарозы, причем оба процесса проводят в противотоке

Фермент

Сохранение активности эы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2), причем вначале проводится иммобилизаITèÿ дрожжевой инвертаэы, а сверху — им-! мобилизация слоя грибной инвертазы.

В результате число слоев иммобилизованной инвертаэы увеличивается с 4 до

6,а активность- с 27 Одо 4910 ед./г носителя. Затеи на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях, Ниже приведены данные по термостабильности препаратов иммобилизованных инвертаз, Стабильность определяли по сохранению активности (в процентах) при хранении препаратов в

0,05 М ацетатном буфере с рН 4,7 при

60 С в течение 3 ч. Препараты с ин дексами возле номеров получены восстановлением активности препаратов после процесса гидролиза сахарозы.

По известному способу

2

За

4а

5а

6а

7а

7б

8а

42

76

73

71

72

\ 8

76

81

64

61

63

69