Способ быстрого определения числа спермиев в пробе
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных. Целью изобретения является повышение производительности и точности способа. Пробу спермы обрабатывают йодистым пропидием, затем дигитонином или сапонином или нистатином, проводя регистрацию флуоресценции на флуориметре. Концентрацию C спермы определяют из соотношения C=Α<SP POS="POST">.</SP>(F<SB POS="POST">2</SB>-F<SB POS="POST">3</SB>)-(F<SB POS="POST">5</SB>-F<SB POS="POST">4</SB>)/F<SB POS="POST">0</SB> млн/мм<SP POS="POST">3</SP>, где F<SB POS="POST">0</SB> - флуоресценция буферного раствора йодистого пропидия F<SB POS="POST">2</SB> - то же, спермы и сапонина F<SB POS="POST">3</SB> - то же, буферного раствора йодистого пропидия и сапонина F<SB POS="POST">4</SB> - то же, буферного раствора F<SB POS="POST">5</SB> - то же, буферного раствора и спермы α - коэффициент, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления спермы.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН (51)5 А 61 D 19/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н nnTEHTV
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 4355308/30-15 (22) 16.03.88 (46) 30.06.90. Бюл. № 24 (71) Иннофинанце алталанош инновациош пензинтезет (HU) (72) Иштван Решли, Тибор Такач, Шандор Дамианович, Реже Гашпар, Лайош
Трон, Янош Селлоши и Янош Матко (HU) (53) 636.082.453.5(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 1336557, кл. С 01 И 33/48, 1985. (54) СПОСОБ БЫСТРОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА СПЕРМИЕВ В ПРОБЕ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных. Целью: изобретения является повышение произИзобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к искусственному осеменению животных.
Цель изобретения — повышение производительности и точности способа.
Пример. Количество живых спермий определяют следующим образом.
1. Интенсивность флуоресценции (F©), растворенного в буферном растворе йодистого пропидия (РЛ), измеряют на 1600 мп раствора красителя с концентрацией 25 мг/л, эта величина служит одновременно стандартом.
2. В .раствор добавляют предварительно разбавленную в 40 л буферного раствора пробу спермы и снова измеряют интенсивность (F,).
3. Затем добавляют к пробе в качестве реактива проницаемости 40 мл. спиртового раствора дигитонина с кон-.
„.Я0„„1575931 A 5
2 водительности и точности способа. Пробу спермы обрабатывают йодистым пропидием, затем дигитонином или сапонином или нистатином, проводят регистрацию флуоресценции на флуориметре. Концентрацию спермы определяют из соотношения: С =о (Р -F g-(F<-F ) /Г„, млн/ммэ, где F, — флуоресценция буферного раствора йодистого пропидия;1 — то же, спермы и сапонйна; Р з, — то же, буферного раствора йодистого пропидия и. сапонина; F — то же, буферного раствора; F — то же, буферного раствора и спермы; сС- коэффициент, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предваритель-.
Ю
: ного разбавления спермы. центрацией 5 мг/мл, снова измеряют интенсивность (F<) .
4. Изготовляют параллельную исходную смесь без пробы спермы: 16ОО мл раствора йодистого пропидия, 40 мл фосфатного буферного раствора PBS (phosphate buffer saline) и 40 мл спиртового раствора дигитонина. Измеряют интенсивность флуоресценции этой пробы Рз.
5. Измеряют интенсивность 1600 мл буферного раствора (F ) ..
6. Добавляют к буферному раствору
40 мл предварительного разбавленной спермы, снова измеряют интенсивность (Р. ) .
На основании измеренных интенсивностей можно вычислить процент живых семенных клеток следующим образом
1575931 живые клетки (Е) = 700 (F1 уо) (РБ Гя) — — 700. (F -F )-(-Г )
3 2 7.
Общее число спермий можно одреде/ лить из одинаковых вели--;ин интенсивности, так как разность между Г и F
2 величина (Г -Гз) образуется à" всех имеющих проницаемость клеток. Величина (Г -Г ) показывает в области 1х 7 0 70
1,5х10 клеток/см линейную зависи7чость от конценграпии клеток. В зтсй области из величины Г -Г можно определять при помощи калибровочной кривой число кле-ок в пробе, Р5
И в этом случае следует принимать в расчет неспецифическое вызванное спермиями повышение интенсивности (г -г„).
Концентрация спермий {миллионы/мм =20 {F <-F э) (F r ) — гце о/- каэффиц: =-
Q йнт, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления 25 спермы.
Калибровочная кривая может сниматьСя в цитаметре потока на маркированных йодистым пропидием пробах спермы а, !
Э следующим образом ..
Исследуемую суспензию клеток разбавляют буферным раствором PBS po концентрации 0,5-2х10 клеток/MT. » 7 мл этой суспензии охлаждают ва льду к разбавляют 1 мл 1Х-наго раствора NP40 (раствор Нонидет Р-40. изготовитель: Сигма Хеми ГмбХ, Дайзенхофен„
ФРГ) . В результате обработки убывают все клетки, их клеточные оболочки становятся праницаемыми для йодисто-го пропидия.
Затем добавляют к проСе такое количество растворенного в ауфернам растворе PBS йодистого прапидия, чта-,1» бы конечная концентрация составляла
30 мг/мл.
Окрашенную пробу анализируют в цк= тометре потока, например в цитометрс
Бектона-Дикансана типа FACS III, са (9 скоростью потока 1500 клеток/с. Возбуждение происходит при помощи аргонионнага лазера при длине волны ч88 нм, амиссию регистрируют в области длины волны выше 620 нм прк проме- „
55 жуточном включении праницаемого вверх " режущего фильтра.
Во время анализа протекающие мима клетки считает прибор на основании интенсивности флуаресценции, а так как клетки благодаря обработке все становились проницаемыми и все поглощали краситель, подсчитанное число соответствует абсолютному числу клеток. Точным определением израсходованного количества пробы, учитывая коэффициент разбавления, получают первоначальную концентрапию клеток пробы. Зта концентрация должна соответствовать величине, измеренной на спектрафлуориметре для одинаковой пробы
Fо
Из пробы изготовляют ряд разбавленкй и в результате серии цитаметрических и спектрофлуориметрических измерений в различных областях концентраций определяют абсолютные количества клетак, принадлежащие к измеренным на спектрофлуариметре коэффициентам интенсивности, Точность этих величин гарантируется многократно повторенными измерениями, Так как величина коэффициента интенсивности изменяется линейно с изменением концентрации клеток, .можно для каждого исследованного вида спермы построить прямую, на основаник которой можно определкть принадлежащие к измеренным коэффициентам интенсивности количества клеток.
Умножением тангенса крутизны (тангенса угла наклона) калибровочной кривой на степень разбавления пробы спермы получают коэффициент g. Последний, умноженный на измеренный коэффициент интенсивности, дает непосред-. ственна концентрацию клеток пробы.
Ф а р м у л а и з о б р е т е н и я
Способ быстрого определения числа спермиев в пробе, включающий обработку клеток веществам,, придаюшим проницаемость оболочке клетки и растворам флуоресцентного красителя в буфере с последующей регистрацией сЬлуоресценции к определением числа клеток в пробе, отличающийся тем, что с целью увеличения производительности и точности способа,, в качестве флуоресценч-ного красителя используют Йодистый пропиций, B качестве вещества придающего проницаемость оболочке клетки, — сапанин или дигитонин, или нистатин, обработку клеток
Составитель И.Марченко
Техред М.Дидык Корректор О.Цинле
Редактор А.Долинич
Заказ 1793 Тираж 462 Подписное
3НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101
5 157593 ведут вначале йодистым пропидием, а затем сапонином или дигитонином, или нистатином, регистрацию флуоресценции проводят на -фотоэлектронной уста5 новке, причем отдельно измеряют флуоресценцию буферного раствора йодистого пропидия (Р ), буферного раствора йодистого пропидия и спермы (F ), буферного раствора йодистого пропидия, 10 спермы и сапонина (F ), буферного раствора йодистого пропидия и сапонина (Р ), буферного раствора (F ), буферного раствора и спермы (Р ), концент1 б рацию С спермы определяют из соотношения
С= (.- .)-(а- ) — мпн мм, где с — коэффициент, полученный умножением тангенса крутизны калибровочной кривой на степень предварительного разбавления спермы, а количество М живых клеток — из соотношения (Р Ро) (Рд Р4) (Р,-F,) -(F -Р,)
