Способ внутритиповой дифференциации полиовирусов

 

Изобретение относится к вирусологии и может применяться для дифференциации вирусов полиомиелита. Цель изобретения - повышение точности дифференциации. Изоляты вирусов полиомиелита параллельно культивируют в фиброобластях эмбриона человека и перевиваемой культуре Нер=2 и при наличии разницы в титре *982,0 LG ЦПД 50/мл, 2,0-3,0 ЦПД 50/мл и *98 3,0 LG0 ЦПД 50/мл относят к диким, промежуточным 0или вакционным соответственно. 2 табл. 0LDЦПД относятся к диким 50/мл, промежуточным или вакцинным соответственно. 2 табл.

1 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 С 12 И 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A ВТОРСЙОМУ СВИДЕтеЛьсТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4485574/30-13 (22) 21.09.88 (46) 07.08.90. Бюл. И 29 (71) Молдавский научно-исследовательский институт профилактической и клинической медицины (72) К.И.Спыну, В.П.Буткарев, Т.П.Грушко, П.Г.Скоферца и С.С.Кострица (53) 576.8.094,29 (088 ° 8) (56) Ворошилова М.K. Знтеровирусные инфекции человека. - И., 1979, с. 148189.

Казанцева В.А. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. - И., 1982, с.43-59 °

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для дифференциации вирусов полиомиелита.

Цель изобретения -. повышение точности дифференциации.

Для этого исследуемые изоляты вирусов полиомиелита параллельно культивируют в фибробластах эмбриона человека и перевиваемой линии клеток

Нер-2 и при наличии разницы в титре

2в,0; 2-3 и ) 3е0 1g ЦПД 0 ми от- носят к диким, промежуточным или вакцинным соответственно.

Пример 1. Приготовление тесткультуры. Ткани туловища и конечностей плода 2-4 мес беременности измельчают ножницами до мелких кусочков размером 2-4 мм, затем промывают три

2 (54) СПОСОБ ВНУТРИТИПОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПОЛИОВИРУСОВ (57) Изобретение относится к вирусологии и может применяться для дифференциации вирусов полиомиелита. Цель изобретения — повышение точности дифференциации. Изоляты вирусов полио-" миелита параллельно культивируют в фибробластах эмбриона человека и перевиваемой .культуре Нер-2 и при наличии разницы в титре <2,0 1КЦПДso(n ь 2, 0-3, 0 ЦПД мл и > 3, 0 1аИПД ьа/мл относится к ди ким, промежуточным и вакцинным соответственно.

2 табл. раза в растворе Хенкса, рН 7,4. Измельченную ткань трипсинизируют.

Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 1500

2000 об /мин в течение 15 мин и помещают в холодильник до смешивания с клетками последующих экстракций.

Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 1500.-2000 об. /мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде с О,Q-ным раствором гидролизата лактальбумина на растворе

Хенкса, рН 7,0. Осадок ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 250 тыс. клеток в 1,0 мл. В качестве среды для выращивания клеток использовали

50

3 15834 среду с 0,53 гидролиэата лактальбумина на растворе Хенкса„ РН 7,0„ среду .199 на растворе Хенкса, РН 7,2, s каждую из которых добавляли сыворотку крупного рогатого скота (10,03) и антибиотики из расчета 25 тыс.единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды.

Перед пересевом культуры Нер-2 проводят просмотр и оценку монослоя.

Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко au раженными границами между клетками„ !

Клетки снимают со стекла матрасов трип-! син-версеном. Для этого готовят смесь равных объемов 0,25ь-ного раствора, трипсина и раствора версена, подогревают ее в водяной бане до 30-35 С.

Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают три раза фосфатно-буферным раствором (РН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью (трипсин-версен) заливают монослой культу= ры клеток. В матрасы объемом 100, 250 и 1000 мл раствор добавляют соответственно по 10, 15 и 30 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат . (37 С) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла.

Взвесь клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в

0,1 мл содержалось 60 тыс. клеток.

В качестве среды для выращивания

33 клеток используют среду Игла, МЕИ, РН 7,2, с добавлением телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота (10,0!ь-ной) и антибиотиков. @

Первично трипсинизированные клетки

ФЗЧ и перевиваемые Нер-2 разливают в пробирки по 1,0 мл.Для поддержива- . ния клеток используют приведенные питательные среды без добавления сыворотки. В пробирках среду меняют через 4 сут культивирования клеток.

Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдают через 56 сут.

Пример 2. Проводят сравнительную внутритиповую дифференциацию

96 вирусов полиомиелита, выделенных от больных полиомиелитом, из сточных вод, а также стандартных штаммов: диких - Nahoney, МЕР-1, Saukett, и вакцинных - Ls с2ав, Р712СЬ 2ав и

L еоп12з в, по ряду известных маркеров (ret 40, Lu, А А, N, Ag), а также по предлагаемому признаку фЭЧ.

Титрование иэолятов вируса осуществляют параллельно в культуре клеток

ФЭЧ и Нер-2 методом конечного разведения по цитопатическому действию и выражают в f.g ЦПД,. Для титрования полиовирусов готовят десятикратные разведения от 10 до 10

Перед заражением MoHocfloR культуры ФЗЧ и Нер-2 полиовирусами производят 3-кратное омывание культуры клеток от сыворотки Раствором Хэнкса, РН 7,4, или раствором Эрла, РН 7,6.

На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по четыре пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал вносят на монослой клеток в объеме

0,1 мл, затем клетки инкубируют при

37,0+0,1 С в течение 60 мин, после

:- его вносят поддерживающую среду . без сыворотки. Инкубирование зараженных полиовирусами культур ФЭЧ и Нер-2 производят при 37,0+0,1О С в течение

7 дн. Результат цитопатического действия ЦПД полиовирусов считают положительным, если не менее половины клеток в культуре подвергались специфической дегенерации.

Результаты исследований уровня

РепРодукции изолятов вирусов полиомиелита того или иного иммунологи-, ческого типа в параллельно зараженных культурах ФЭЧ и Нер-2 учитывают при соблюдении следующих контролей: монослой незараженных культур Нер-2 и ФЭЧ должен сохраниться до конца опыта, т.е. до седьмых суток включительно после заражения (контроль культуры клеток); разница в уровне репродукции в культуре клеток Нер-2 и ФЗЧ для аттенуированных стандартных полиовирусов (La c2aa, Р712СЬ2ав, Ьеоп12а в) цолжна бы1 ь >10 ЦПД 50)мл тогда как для диких (уличных стандартных вирусов полиомиелита (Mahoney, МЕР-1, Saukett)) этот показатель составляет 10 " ЦПД (табл. 1)

Статистическая обработка данных

Репродукции аттенуированных, промежуточных и диких (уличных} штаммов вирусов полиомиелита свидетельствует о том, что разница в уровне Размножения в культуре клеток ФЭЧ и Íåð-2 для отдельных указанных групп полиовирусов внутри одного и того же иммунологического типа достоверно отлиS

Табли ца 1

КультуШтамм

РазниТитр вируса

° цп ра клеца титров в

1g ток

Нер-2

ФЭЧ нер-г

ФЭЧ

Нер-2

ФЭЧ

Нер-2

ФЭЧ

Нер-2

ФЭЧ

Нер-2

ФЭЧ

7,2+0,21

S,4+0,20

7,9+0,21

7,1+0,20

6,4+0,22

4;8+0,23

6,8+о,г3

З,4+0,22

7,6+0,23

4,4+0,20

6,1+0,20

3,1 0,20

1,8

Mahoney

MEF-1

0,8

1,6

Saukett

Ls Сгав

3,4

Р7 1гсьгаа

3,2

3,0

5 158 чается (P = 0„001). Из 44 исследованных полиовирусов всех трех иммунологических типов, для 14 штаммов виру1са полиомиелита типа I, умеющих генетическую характеристику ret 40, Lu, А+-, М, а в антигеннрм отношении сходных со штаммами Коньков, Коньков +

+ Ьвс2ав и Mahoney разница составляет (2,0 1g ЦПД г, „ . Исключение составляет один штамм, имеющий гене-, тическую характеристику ret 40, Lu

А, N, а в антигенном отношении сходный с промежуточным вариантом

Коньков + LSc2ae. Для этого штамма разница в тит1 е составила 2,5 1дЦПД, Остальные 39 штаммов этого же типа имеют генетическую характеристику ret. 40, Lu-, А+, N -, а в антигенном отношении сходны со штаммом Ьвс2ав. В данном случае разница титров вирусов полиомиелита

3,0 1КЦПДq q (табл. 2). Сходные резул таты получают при параллельной количественной индикации 22 и 30 штаммов полиовирусов типа

IT. u III соответственно в этих же культурах клеток. Величина разницы титров штаммов вирусов полиомиелита типа II, имеющих характеристики ген

40, Lu +, А, N а в антигенном отношении сходных со штаммами МЕР-1, была < 2,0 1g ЦПД -, „, тогда как для остальных 18.штаммов полиовирусов, у которых известные генетические маркеры ret 40, Lu+, А, 0+ не коррелируют между собой, а в антигенном отношении сходные со штаммом Р712СЬ2ав, эта же величина составляет >30 1@ ЦПД sores

Такая же динамика размножения характерна и для штаммов полиовируса типа

III. Уровень размножения 18 штаммов

3441 6 вируса полиомиелита, имеющих генетическую характеристику ret 40, Lu+, A+ и сходных в антигенном отношении со штаммом Saukett был на (2,0 1g ЦПД а, выше в клетках Нер-2,чем е ФЭЧ. Для 12 штаммов втруса полиомиелита типа III сходных по некоторым генетическим признакам с вакцинными штаммами эта разница составляет )3,0 1g

Llrln о / A

Применение способа внутритиповой дифференциации энтеровирусов rlc. признаку фЭЧ опережает по стабильности ряд генетических признаков, в том числе Ms, и во всех случаях совпадает с антигеHHblM n sHaM (Ag) ° Это позволяет использовать признак фЭЧ как новый генетический маркер, обеспечивающий более точную предварительную дифференциацию вирусов полиомиелита на вакцинные, промежуточные и дикие варианты.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ внутритиповой дифференциации полиовирусов, включающий установленные разницы титров при параллельном выращивании вируса в двух культурах различного происхождения, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности дифференциации, в качестве культур используют фибробласты эмбриона человека и перевиваемую линию Нер-2 и при разнице в титре меньше 2 1g ЦПД 50/мл

2,0-3,0 1g ЦПД в м и больше 3,04

4.g ЦПД „„штаммы относят к диким, промежуточйым или вакцинным соответственно.

1583441

Табл и ц а 2

Тип вируса полио миелита

Признаки

Разница титров полиовирусов в культурах клеток

Нер-2 и ФЭЧ в ЦПД ;(*

Число штаммов

Lu A

ret 40 указанной комбинации

1,710,20

1,8+0,21

2,5+0,20

Коньков

Коньков +

Ls с2ав

Ls с2ав

lI

lI

II

11

МЕЕ-1

P712Ch2aa

«11

«1I

«1I

«н н

«I l»

Saukett

Ьеоп12а „a

П р и м е ч а н и е. Признак N-патогенность вируса полиомиелита типа II для белых мышей °

Составитель О.Жакетов

Реда ктор Н. Я цола Техред Л. Олийнык Корректор И.Муска

Заказ 2231 Тираж 482 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. М5 г.ужгород, ул.Гагарина, 101

Производственно-издательский комбинат "Патент", 3,5+0,20

3,4@0,20

3,2+0,24

3,4+0,20

3,6+0,22

3,7+0,22

1,5+0,20

3,2+0,22

3,2 0,24

3,2+0,24

3.,4+0,20

3,6+0,22

3,2+0,22

3,6+0,22

1,8+0,24

3,0+0,20

3,6+0,24

3,6+0,24

3,0+0,20

3,0+0,20

3,0+0,20

2

2

2

8

18

4

2

44

22