Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к человеческому коллагену iy типа

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L, продуцирующего моноклональные антитела к человеческому коллагену IY типа. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной человеческим коллагеном IY типа, с клетками миеломы мыши Х63.Р3/Ад 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 164Д. Гибридому культивируют в среде ДМЕМ с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сывороткой, 24 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгизона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37°С в атмосфере 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Штамм продуцирует моноклональные антитела класса I дМ, которые специфически связываются с человеческим коллагеном IY типа. На 3-4 день культивирования концентрация моноклональных антител составляет 1-10 мг/мл в культуральной жидкости и при культивировании в организме животного в асците - 10-30 мг/мл.

СОЮЗ СОНЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 1602866 А 1 (51)5 С 12 N 5/ОО р,=Г "„"19.К6

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4620265/30-13 (22) 15.1 2.88 (46) 30.10,90. Вюл. К 40. (71) Всесоюзный кардиологический научный центр ЛМН СССР (72) И. H. Трахт, A. В. 1 удин, Г. Л, Идельсон и С. 11, )1омогатский (53) 578.085.23(088.8) (56) Madre J. A., Рurtl>mayr П.

Amer.,1. Patho1, 1979, v. 94, 322

332. (54) ШТАММ 1 ИВ1-1ЩШ 1Х КУЛЬТИВИ1 УЕИ>1Х

КЛЕТОК ЖИВОТ1П 1Х MVH ГПЗВСЦ1.ЦВ 1 ., ИСПОПЬЗУЕ1Ь1Й ДЗИ 11031УЧЕ1ИИ М0НОК.110НЛ.11ЬН111Х А11ТИТЕ11 К ЧЕJIOBI .ЧЕСКОМУ К(ЦП1ЛГЕНУ IV THIIA (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.,,продуИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в медицине и биологии.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L продуцирующего моноклональные антитела к человеческому коллагену IV типа.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВАЬВ/С иммунизируют подкожно введением 50 мкг человечесе кого коллагена IV типа в 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда..Через 10 и

20 дней после первого введения прово-. цирующего моноклональные антитела к человеческому коллагену IV типа.

Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мыши линии ВЛ1.В/С, иммунизированной человеческим коллагеном

IV типа, с клетками миеломы мыши

Х63.РЗ/Ag 8 ° 653. Штамм депонирован под номером ВСКК(И) К 16411. Гибридому культивируют в среде ДМЕМ с бикар бонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ 1.-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгиэона, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола при 37 С в атис сАере 5% СО, .

Штамм продуцирует моноклональпые антитела класса ТдМ, которые специфически связываются с человеческим коллагеном IV типа, lla 3-4 день култ тивирования концентрации моноклональных антител составляет 1-10 мг/мл в культуральной жидкости и при культивировании в организме животного в асците

10-30 мг/мл. дят дополнительные иммунизации аналогичным образом. Через 3 дня после последней иммунизации иммунных мьпчей забивают, 15х10 клеток селезенки гиб- (3Ъ ридизуют с 5х10 клеток миеломы мыши

Х63.РЗ/Ag.8.653 в течение 1 мин в . присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 50% (по объему) полиэтиленгликола (1!ЭГ) мол.массы 1000 и 15% диметил 3 сульйоксида. После гибридизации и отмывки клеток средой DNFM от 1131 клетки высевают в 96-луночные панели по

1х10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют

3 160286.6,4" среду DMEM с добавлением 20% эмбриональной коровьей сыворотки., 2 мМ Ьглутамина, 10 мМ пирувата натрия,, 100 мкгlмл канамицина, 5 мЖФшл @унии 5 зона 0,05 мМ 2-меркаптоэтаисща», 0„.1 9% гидрокарбоната натрия, 100 мкИ випоксантина, 0,4 мкМ аминоптеринд, 1 6 мМ тимидина в атмосфере 5% угреяиелого газа при 37 С.

1 0

Гибриды отбирают по споавбжелаи продуцировать антитела к ищшипжн@, Отобранные гибриды дважды т@ия щцйве методом конечных разведений Июаие повторного клонирования пракшицески

100% субклонов продуцируют антитела к коллагенам. Продукция этих антител сохраняется, по крайней мере до

50 пассажа.

Условное наименование штамма НС4.

Условное наименование анриввп синтеэируемых штаммом НС4, Ам04.

Штамм депоьирован во Ввеаоюеной коллекции клеточных культур пад напором ВСКК(П) 1Ф 1 64Д и харак"тжр ищуется 25 следующими свойствами.

Культуральные свойства.

Культивирование гибридных клеток

НС4 проводят в пластиковых флаконах.

Посевная доза 100 тыс. клеток в 1 мл плотность в монослое 1х10 клеток/мл.

Культуру пассируют как суспензионную в дозе 100 тыс.клеток в 1 мл 1 раз в

5 дней или в дозе более 100 тыс.клеток в 1 мл 1 pas в 3 дня. Через

3-4 дня в культуральной среде можно обнаружить моноклональные антитела к коллагену, концентрация которых составляет 1-10 мг/мл в.зависимости от посевной дозы.

Клетки штамма НС4 культивируют также в организме животных. Интажтным мышам линии BALB/Ñ эа 10 дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшкино (в/бр) по 0,5 мл пристана. Ша.амм инъ- 45 ецируют в/бр. по (1-5) х 10 и еток в

1 мл среды Игла. Асцит образуется че-рез 8-.12 дней. Концентрация анаич ела в асцитной жидкости 10-30 мг/мд,. Возможна, по крайней мере, двукредная перевивка штамма с сохранением продукции антител.

Стандартные условия кульгивирования. Среда DMEM с бикарбонатом и 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ.L-глутамина, 2 мИ пирувата натрия, 55

100 мкг/мл канамицина, 5 мкг/мл фунгиэона, 0,05 мИ 2-меркаптозеанела при .37 С в атмосфере 5% углекислого газа.

Характеристика полезного продукта штамма. Вгамм продуцирует монокло-. нальные антитела — иммуноглобулины мыши класса Х. Эти антитела специфически евязываюшся с человеческими коллагеном ХЧ типа, с незначительной перекрестной реакцией с коллагеном I типа. В пределах чувствительности использованных методов не обнаружено связывание с человеческими альбумином, фибувногеном, фнбронектином и коллаге нами IXX u V типов. Присутствие плазмы иреви не влияет на взаимодействие мончжленальных антител с человеческим келлагеном IV типа.

Клетки штамма консервируют по 1 х х 106 клеток/мл сыворотки крупного рогатого скота с добавлением 10% диметилсулъфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке иа вспененного полистирола с толщинвй стенок 1 см. Коробку с ампулами оставляют при -70 С,и через

1 сут переносят ампулы в жидкий азот для хранения.

Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37 С. Жизнеспособность после размораживания, оцениваемая по включению трипанового синего, составляет не менее 60%.

Контаминацию бактериями и грибами в культуре не обнаруживают при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды. Заражение микоплаэ мами не выявлено методом гибридизации клеточной ДНК с универсальным диагностическим зондом (плазмидой РИС16), содержащим фрагмент рибосомного гена, общего для всех видов мнкоплазм.

Пример 1. Определение связывания антител АмС4 с коллагенами I, III, IV u V типов, фибриногеном, альбумином и фибронектином человека.

На дно ячеек 96-ячеечной полистиролоаой панели сорбируют белки, с которыми определяли связывание антител.

Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раствора белка с концентрацией

1.0 мкг/мл в 200 мИ бикарбонатном буферном растворе, рН 9,0 и оставляют на 16 ч при 4 С. После пятикратной промывки забуференным физиологическщ раствором (ЭФРТ7, содержащим 5 мМ

Na8, P0g, 140 мМ Na01, 0,05% твина 20, рН 7,4, в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды от штамма НС4 или раствора ЭФРТ, содержащих могоклональное антитело АмС4 в различной концентФо р и у л а и з о б р е т е н и я

Составитель А. Маныкин

Редактор Н. Кинтулинец Техред Jt.Сердюкова Корректор Т, Колб

Заказ 3360 Тираж 487 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС(,Р

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина,101

5 16028 рации, и инкубируют 30 мин при 37оС, Несвязавшиеся антитела отмывают ЭФРХ

5 раз, в ячейки вносят ковалентно связанные с пероксидаэой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мьппи с концентрацией 5 мкг/мл в 50 мкл раствора ЭФРТ. Через 30 мин инкубации о при 37 С несвязавшиеся антитела отмывают указанным выше способом, а количество оставшейся в ячейках пероксидазы, пропорциональное количеству молекул антител АмС4, определяют коли-чественно по расцеплению субстрата для пероксидазы (Н О,) в присутствии хромогена - ортофенилендиаминл. Реак9 цию останавливают добавлением 50Х-ной серной кислоты до конечной концентрации 5Х.

Положительная реакция проявляется 20 изменением окрашивлния от желтого до коричневого и просчитывается нл. спектрофотометре при длине волны 490 нм.

Результаты примера .1 свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с коллагеном IV типа в диапазоне исследованных концентраций. Наличие некоторой перекрестной реакции с коллагеном 1 типа не может служить препятствием при использовании антител АмС4 для выявления блзлльной мембраны ввиду отсутствия и базальной мембране колллгенл 1 типа.

II.р и м е р 2, Определение связывания антител АмС4 с человеческим кол лагеном IV типа в присутствии нлллмы крови человека.

Антитела АмС4 инкубирувт в плазме крови или в ЭФРТ 30 мин ври 37 С и

66 6 затем добавляют к коллагену. Дальней шие определения проводят аналогично описанным в примере 1 °

Иэ данных примера 2,следует, что присутствие плазмы крови, по сравнению с раствором ЭФРТ, не изменяет связывания исследуемых антител с коллагеном IV типа.

Результаты приведенных примеров однозначно свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела АмС4, вырабатываемого штаммом НС4, и показывают возможность использования указанных антител для типирования опухолей, выявления мест инвазии опухоленых клеток,в стенках сосудов; для

t исследования синтеза и экспрессии кол.лагена IV типа различными клетками человека при культивировании их in

vitro; для изучения распределения колллгена IV типа в различных органах и тканях человека в иммуногистологическнх исследованиях, как в норме, так и прн патологии.

Таким образом, предлагаемое моноклонлльное лнтнтело имеет большое прлктическое .значение и может быть использовано в самом широком круге задлч, свлллнных с проблемлми биологии и медицины.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных t1us musculus I.. ВСКК(П)

164I) используемый для получения моноклонлльных антител к человеческому колллгену IV типа.