Способ получения гибридного интерферона типа @ 1/ @ 2

 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способам получения гибридных интерферонов типа ω<SB POS="POST">1</SB>/α<SB POS="POST">2</SB>. Плазмидой P RHW78 трансформируют штамм E. COLI HB 101, отбирают штамм, продуцирующий интерферон, и путем последующей очистки получают интерферон формулы R<SB POS="POST">1</SB>-GLU ILE PHE - R<SB POS="POST">2</SB>, где R<SB POS="POST">1</SB> - пептидная последовательность α<SB POS="POST">2</SB>-интерферона

R<SB POS="POST">2</SB> - пептидная последовательность ω<SB POS="POST">1</SB>-интерферона.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 С 12 N 15/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ ностью этого интерферона после BglII-места разреза

R — GluI1 eP he — R ! 2) CAG АТСТТС

BglII

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4202086/30-13 (22) 09.03.86 (31) R 3607835,2 (32) 10,03,86

„(33) РЕ (46) 30, 10.90. Бюп. Р 40 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (РЕ)

1 (72) Рудольф Гауптманн, Петер Светли, Петер Мейндль, ГМнтер Адольф, Эдгар Фалькнер, Герхард Бодо и Ингрид Маурер-Фоги (AT) (53) 577,2 (088.8) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу получения гибридных интерферонов формулы где BglII означает совместное BglII— рестрикционное место М /И„-интерферонов;

R — пептидная последовательность

М -интерферона, кодируемая

ДНК-последовательно стью этого интерферона перед

BglII-местом разреза;

R — пептидная последователь2 ность Я -интерферона, кодируемая ДНК-последователь„„SU„„1604164 А 3

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО

ИНТЕРФЕРОНА ТИПА 63, /О а (57) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу получения гибридных интерферонов типа G3, /К . Плазмидой р И%78 трансформируют штамм E. cnli НВ 101, отбирают штамм, продуцирующий интерферон, и путем последующей очистки получают интерферон формулы R

GluIlePhe-К, где К, — пептидная последовательность 0/ -интерферона;

R — пептидная последовательность

Я,-иитерферона. 3 табл. или

R — пептидная последователь1 ность Ю1 -интерферона, кодируемая ДНК-последовательностью этого интерферона перед BglII-местом разреза;

К - пептидная последователь2 ность М -интерферона, коди-, руемая ДНК-последователь.— . ностью этого интерферона после BglII-места разреза; или их N-концевых мет- или N-формилмет-производных или их N-гликозилиро-, ванных производных, а также необходи-,. мые для экспресии репликонные и конт-:-рольные последовательности плазмиды рЕИОЗ, имеющие формулу

1604164

5 AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGÑÑÒÒÑ

3 GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

Промотор

GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTÒÒÀÀGÑÒ

CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA

Промотор/оператор -+ - -рНК-старт — - рибоз, †11 линTAAAGATGTGT — ——

ATTTCTACACACTAG— реп - — ген —

Пример 1. Плазмиду рАТ153 режут рестриктазами BamHI u PstI.

Получаемые фрагменты разделяют в

l -ном агаровом геле и выделяют большой фрагмент, содержащий начало репликацни„ лигируют его с полученным из плазмиды parER33, расщепленной теми же рестриктазами, меньшим фрагментом

Т -ДНК-лигазой, Для осуществления репликации плазмщi бактерии Е.coli штамма НВ101 промывают раствором хло-„ ристого калия, полученные компетентные К, coli HB101 смешивают с лигированной ДНК и инкубируют при 0 С с нагревом до 42 С в течение 2 мин.

Затем трансформированные бактерии наносят на содержащие ампициллин

ЬВ-агаровые пластинки (ЬВ-среда +

+ 15 г/л агара). После инкубации при

37 С выбирают 12 иэ полученных колоний и выделяют из них плаэмиды, Двойным перевариванием выбранных плазмид рестрикционными энзимами РзСХ-BamHI, PstI-PvuII или EcoRI-,ÂàmHI и последующим гелевым электрофорезом получаемых фрагментов подтверждается правильность конструкции этих плазмид, Полученную таким образом плазмиду обозначают рагрАТЕКЗЗ Эта плазмида, трансформированная в Е. coli НВ101, проявляет фенотип Ар" (устойчивый к ампициллину) и Тс" (устойчивый к тетрациклину). Плазмиду рагрАТЕКЗЗ расщенляют рестриктазами HindIII u

BamHI. фрагменты разделяют в l -ном агаровом геле. Выделяют наибольший, имеющий около 3750 пар оснований (п,о.), фрагмент (фрагмент а), содержащий триптофановый промотор/опера М тор, начало репликации и ген Ар, и лигируют с ДНК, кодирующей Я1 -интерферон. Эту ДНК получают путем разрезания кодирующей Я, -интерферон

25 плазмиды pRHV11 (или рИ%12) рестриктазами BamHI u HindIII и последующего разделения обоих фрагментов путем гелевого электрофореза, причем желае-. мый ген содержится в меньшем фрагменте с длиной около 800 п,о, Для осуществления репликации получаемых плаэмид растворомхлористого кальция промывают Е.col i HB101 смешивают их с реакционной смесью лигированной ДНК и пос35 ле инкубации при 0 С плазмидную, ДНК поглощают бактериями путем нагрева до 42 С в течение 2 мин ° Трансформированные бактерии наносят на содержащие ампициллин ЬВ-агаровые пластин40 ки. После инкубации при 37 С выбирают 6 из полученных колоний и выделя.— ют из них плазмиды. Перевариванием выбранных плазмид рестрикционными энзимами EcoRI, HindIII, NcoI u PstI

45 и последующим гелевым электрофорезом подтверждается правильность конструкции этих плазмнд. Плазмицу, кодирующую Q< -интерферон (01и), обозначают как рКНИ4, если в качестве исходной плазмиды испОльзуют рКНИ12, кодирующуюЯ;интерферон (Glug

Эта плазмида, трансФормированная в E. coli НВ101, проявляет фенотип Ар" и Тс

При использовании в качестве исходной плазмиды pRHW11 аналогично получают плазмиду pRHW13, кодирующую

Я,-интерферон (Glu). Получаемая таким образом плазмида рИК14 имеет в два.5 1604 раза большую степень экспресии для

iC g -интерферона (Glu), чем известная плазмида рИ%12. Плазмиду рагрАТЕКЗЗ и кодирующую Я1-интерферон плазмиду

pRHW14 режут BglII u SphI. Получаемые при этом фрагменты разделяют в

1 -ном агаровом геле, элюируют и очищают посредством осаждения этанолом.

После растворения фрагментов в ТЕбуфере получаемый из плазмиды ° рагрАТЕКЗЗ большой фрагмент лигируют с получаемым из плазмиды pRHW14 меньшим фрагментом в присутствии Т -ДНКлигазы. Для осуществления репликации получаемых плазмид раствором хлористого кальция промывают бактерии штамма Е. coli НВ 101, Компетентные Е. coli НВ 101 смешивают с лигированной ДНК и после инкубации при

0 С плазмидную ДНК поглощают бактериями путем нагрева до 42 С в течение 2 мин, Затем трансформированные бактерии наносят на содержащие ампициллин ЬВ-агаровые пластинки (LBсреда + 15 г/л агара). После инкуба" ции при 37 С отбирают несколько колоний и выделяют из них плазмиды.

Двойньщ перевариванием выбранных ,плазмид рестрикционными энзимами

BglII и БрЫ и гелевым электрофорезом получаемых фрагментов подтверждается правильность конструкции этих плазмид, Плазмиду обозначают как

pRH72.

Эта плазмида проявляет фенотип

Ар" и Тс, кодирует 0 /Ю,-интерферон (Glu) (BglII).

Для получения кодирующей гибридный интерферон формулы (I) плазмиды, содержащей перед совместным местом разреза В@1ХУ кодйрующую Я1-интерферон последовательность ДНК, следует осуществлять две стадии, если в последовательности ДНК k-интерфе рона имеются два места разреза BglII, как и в последовательности ДНК М вЂ” интерферон (Ар"), При этом на первой стадии получаемый из плазмиды рИ%14 путем разрезания BglII u

SphI большой фрагмент лигируют с получаемым из плазмиды рагрАЕБЗЗ путем переваривания с BglII u SphI фрагментом, который кодируетС-конецно -интер-. ферона (Ар") в присутствии Т -ДНК-лига4 зы. Для осуществления репликации получаемых плазмид бактерии Е. col i НВ101 трансформируют и культивируют с последующей проверкой конструкции этих

164 6 плазмид. Выбирают получаемую таким . образом плазмтщу и обозначают

pRH77. Плазмиду pRH77 разрезают Bglll и 5 -концевой фосфат удаляют фосфата-. зой телячьего кишечника. Линеаризи.рованную плазмиду pRHW77 разделяют в

1 .-ном агаровом геле, выделяют и очищают посредством осаждения этанолом, после растворения в ТЕ-буфере лиги-, руют с фрагментом с длиной 263 п.о., полученным при переваривании parp

ATER33 рестриктазами BglII H SphI в присутствии Т -ДНК-лигазы. Бакте-, рии E. coli НВ101 трансформируют и культивируют с последующей проверкой правильности конструкции плазмид путем разделения рестрикционными эндонуклеазами AluI u HaeIII. При

20 этом на основании идентичных концов введение фрагмента с длиной 263 п.о. осуществляют в двух направлениях, Плазм щу, в которую фрагмент BglII с длиной 263 п.о. введен в правильном для экспрессии положении, обозначают как pRH78r, а плазмиду с неправильным для экспрессии направле- нием — как pRH78f.

Обе плазмиды, трансформированные в Е. coli НВ101, показывают фенотип

Ар" и Тс

Для осуществления репликации или экспрессии новые плазмиды могут быть внесены в бактериальный хозяин.

35 При этом пригодны прокариоты, как, например, Е, coli К12, штамм 294 (АТСС 11 .31,446), Е. coli Х1776 (АТСС

Ф 31.537), Е. coli W3110 (F прототроф, АТСС У 27.325), Е. coli

40 НВ101 ((F, hsdS20 (3, m ), гесА13, ara-14, proA2, lacV1, galK2, тpSL20 (smr), ху1-5, mtl-1, sup Е44,ф ), бациллы, как например, Bacillus

subtilis и другие энтеробактерии, 45 как Salmonella typhimurium или Serratia marcenses, и различные псевдомонады. Для экспрессии новых гибридных интерферонов формулы (I) в

Е. coli трансформируют и культивируют, 5Р например, плазм щу pRH72, pRH78f и

pRH78ã. После разрушения стенок клеток и удаления центрифугированием обломков бактерии антивирусную активность экспримированных полипептидов определяют в клеточной надосадочной жидкости. Клеточные надоса-, дочные жидкости, полученные из штамма Е. coli, трансформированного

pRH72, и штамма Е, cali, трансфор7 1604164 8 мированного pRH78f, не имеют антиви-, русных свойств. Получаемая из плазмиды pRH78r клеточная надосадочная

ЖИДКОСТЬ Содаржащая (Й» /Я ИНТЕрфЕ» рон (Bglll), имеет в четыре раза большую специфическую антивирусную активность на А549-клетках, чем М интерферон (Ар"), Пример 2. 10 мкг рагрЕЮЗ в 200 мкл реакционного раствора разрезают 20 ед. BamHI и 20 ед. PstI.

Затем два образовавшихся фрагмента разделяют в 1 .-ном агаровом геле (1 arapa в 1хТВЕ-буфере, состоящем из 10,8 г/л трис(оксиметил)аминометана (далее — трис), 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л динатриевой соли этилендинитрилотетрауксусной кислоты ЭДТУК) и 0,5 мг/л бромида эти- 20 дия, в качестве рабочего буфера используют 1» ТВЕ, электрофорез при

5 В/см; ДНК-фрагменты делают видимыми путем облучения УФ-светом (254 нм) агарового геля. Содержащий с(-интер- 25

Р г ферон (Ар ) меньший фрагмент изолируют электрофорезом ДНК-полос на бумаге DE-81, бумагу промывают в 200 мМ хлористом натрии,, 25 мИ трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТУК, элюацию ДНК осуществляют 30 с помощью 1 M хлористого натрия, 25 мМ трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТУК и, добавляя 2,5 объема этанола, осаждают ДНК. После отделения центрифугированием ДНК высушивают и Растворя- 35 ют в пригодном объеме TE-буфера, состоящего из 10 мМ трис рЯ 8,0 и 1 мМ

ЭДТУК, 10 мкг рАТ153 в 200 мкл реакцион ного раствора также разрезают 20 ед. 40

ВапйП м 20 ед.. PstI, фрагменты разделяют, При этом больший, содержащий начало ренликации, фрагмент выделяют.

Ilo 0,5 мкг очищенных ДНК-фрагментов в 20 мкл реакционного раствора (66 мМ трис рН 7,5, 100 мМ хлористый натрий, 10 мИ хлористый магний, 5 мМ дитиотрейтол, 1 мМ ЭДТУК, 1 мМ трифосфат аденозина лигируют 5 ед. Т ДНК-лигазы. Затем к 150 мкл компетентных бактерий Е. coli НВ101 добавляют 1 мкл продукта реакции лигирования в течение 30 мин при 0 С, инкубио руют и путем инкубации в течение

2 мин при 42 С трансформируют ДНК

55 (компетентные бактерии Е. cali выращивают в LB-среде (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлористого натрия, рН 7,5) до достижения оптической плотности ОП 600 „M =

= 0,3 и центрифугируют. Бактерии повторно суспендируют в 0,5 объема ледяного раствора 50 мИ хлористого каль" ция иинкубируют в течение 30 мин. После повторного центрифугирования бактерии суспендируют в 50 мМ хлористом кальции 1/15 исходного объема. Суспен зию бактерий наносят íà LB-агаровые пластинки (LB-среда + 15 г/л агара) с 50 мкг/мл ампициллина. Через 16 ч инкубации при 37 C выбирают 12 из образовавшихся колоний, из которых в микромасштабе изолируют плазмиды.

Правильность конструкции подтверждается двойным перевариванием рестрикционными энзимами PstI-ВапНХ, PstIPvuII u EcoRI-BamHI с последующим электрофорезом в геле. Выбирают одну плазмиду, которую обозначают как

parpATER33. Е. coli, трансформированный parpATER33, дает фенотип: резистентность к ампициллину и тетрациклину.

10 мкг parpATER33 в 150 мкл реакционного раствора подвергают двой-, ному перевариванию HindIII .и BamHI

Полученные три ДНК-фрагмента разделяют в 1 -ном агаровом геле и наибольший фрагмент, длина которого составляет приблизительно 3750 п.о., выделяют фрагмент. Этот фрагмент имеет триптофановый.промотор/оператор (Serratia marcescens) начало репликации и Ар -ген.

10 мкг рКН1»112 в 150 мкл реакционного раствора также подвергают двойному перевариванию BamH1 и

HindIII. Образовавшиеся два фрагмента разделяют электрофорезом в геле, и меньший фрагмент (фрагмент б), длина которого составляет приблизительно 800 п.о. изолируют (он содержит Я, -интерферон (Glu) -ген. . 40 нг Фрагмента и приблизительно

50 нг фрагмента б в IO мкл реакционного раствора лигируют 5 ед. Т -ДНКлигазы. 200 мкл суспензии компетентных бактерий Е. coli смешивают с раствором реакции лигирования, бактерии трансформируют внезапным нагревом до 42 С и наносят íà LB-агаровые пластинки, содержащие 50 мкл/мл ампициллина. Через 16 ч инкубации при

37 С выбирают 6 колоний, из которых в микромасштабе изолируют плазмидную

ДНК. После переваривания ДНК рестрик9 16 ционными эндонуклеазамн ECoRI, HindIII, NcoI или PstI и последующего электрофореза в геле фрагментов выяснилось, что одна из плазмид имеет желаемую структуру. Ее обозначают как pRHW14. E. coli трансформируют pRHW14 и получают фенотип Ар" и Tcs, Для этого бактерии Е. coli

CSR 603 (F, thr-1, 1еиВ6, proA2, phr-1, recA1, argE3, thi-1, uvrA6, ara-14, lacVI, galK2, xyl-5, mtl-I, gyr A98 (nalA98), rpsL3 1, tsx-33, 9,, sup E44), трансформированные плазмидами pRHW12 и рИ%14, выращивают при 37 С в экспрессионной среде (10 г/л фосфата аммония, 3,5 г/л гидрогенфосфата калия с рН 7,3, 0,5 г/л хлористого натрия, 21 г/л. гидролизата казеина (гидролизован - ного кислотой, свободного от витаминов), 11 г/л глюкозы, 1 мМ сульфата магния, О, 1 мМ хлористого кальция, 1 мг/л тиамина в виде гидрохлорида, 20 мг/a L-цистеина, 100 мг/л ампициллина) до достижения ODsoo 0,6.

10 мл этой культуры подают в открытую чашку Петри и УФ-лампой (15 Вт) установленной на расстоянии 50 см, облучают втечение 5 с и далее в течение 1 ч инкубируют. К культурам добавляют 100 мкг Э-циклосерина для уничтожения способных к размножению бактерий. По истечении 16 ч инкубации при 37 С бактерии отделяют центрифугированием. дважды промывают по 5 мл солевого раствора Гершей (5 4 г/л хлористого натрия, 3,0 г/л хлористого калия, 1, 1 г/л хлористо. го аммония, 15 мг/л хлористого кальция 2Н О, 0,2 г/л хлористого маг" ния в виде гексагидрата, 0,2 мг/л треххлористого железа в виде гексагидрата, 87 мг/л дигидрогенфосфата калия, 12, 1 г/л трис, рН 7,4) и инкубируют в 5 мл среды Гершей (на

100 мл солевого раствора Гершей используют 2,0 мл 20Х-ной глюкозы, 0,5 мл 2Х-ного треонина, 1,0 мл 1X- ного лейцнна, 1,0 мл 2 -ного пролина, 2Х-ного аргинина, 0, мл О, 1Х-ного тиамина в виде гидрохлорида, 20 мкг/мл ИАК-индоакрнловой кислоты.

Добавлением 5 мг/мл S-метионина и дальнейшей инкубацией при 37 С в течение 1 ч новосинтезируемые протеины радиоактивно маркируют. Бактерии отделяют цечтрифугированием и в

04164 !О

200 мкл буфера (ДСН) — додецилсульфата натрия (6,6 мл фосфата натрия с рН 6, 8 р 2 мМ Э?,ТУКу 2Х ДСН, ЗХ гли. церина, 0,02Х бромфенолового сине; го, 0,66 2-меркаптоэтанола) в течео ние 5 мин лигируют при 100 С. Пробы затем разделяют в 15Х-ном полиакрилaMHpFoN геле (разделительный гель:

15 . акриламида, О, 4 . бисакриламида, 375 мМ трис, рН 8,8, 2 мМ ЭДТУК, 0 1Х

ДСН; собирательный гель: 6Х акрилами-. да, 0,16Х бисакриламида, 375 мМ трис, рН 6,8, 2 мМ ЭДТУК, 0,1Х ДСН; электродный буфер: 3,0 г/л трис, 14,24 г/л глицерина, 0,335 г/л ЭДТУК, 0,5 г/л, ДСН; продолжительность электрофореза 16 ч при постоянном значении тока

20 мА). Гель в течение 1 ч фиксируют

20 в 20Х-ном метаноле и 7,5Х-ной уксусной кислоте, в течение 30 мин инкубируют в 5Х-ном метаноле и iX-ном глицерине с последуюшей сушкой. С помощью усилительной фольги гель экспониру25 ют при -80 С на рентгеновской пленке.

Геновый продукт с резистентностью к ампициллину (P-лактамаза) в обоих случаях одинаково маркируется.

О -интерферон в случае pRHW14 более чем в два раза сильнее маркированный, чем в случае рИ%12.

Пример 3. Экстракция Q -ин-! терферон (Glu) из бактерий.

Штамм Е. col i НВ101, трансформи35 роваыный рИ1Ы12/pRHW14, выращивают в экспрессионной среде + 20 мкг/мл

ИАК до OH goo>q> = 20. Бактерии уничтожают добавлением серной кислоты до значения р11 2 и инкубацией в те0 чение 60 мин при 20 С. Бактерии отделяют центрифугированием и биомассу замораживают при -20 С до переработки, Бактерии повторно суспендируют в 10 объемах 1Х ной уксусной

45 кислоты. Добавляя 2 н. гипроокиси натрия, значение рН раствора доводят до 10 и суспензию перемешивают в течение 2 ч при 0 С, Затея значение рН добавлением 2 н. соляной кислоты до50 водят до 7,5 и остатки разрушенных клеток отделяют центрифугнрованием (40С, 10 0000 o6/мин, 30 мин) . Интерфероновую активность в надосадочной жидкости (сыром экстракте) измеряют при помощи известного теста

55.на человеческих клетках А549 (клеточная линия рака легких человека), инфицированных вирусом энцефаломиокардита (ЭМК), с использованием в ка11 16 честве стандарта g<-интерферона (Ap").

При этом биомасса Е, Coli трансформированная pRHW12 дает 100000 ед/г (среднее значение иэ .трех независимых культур), а клон pRHW14 — .

200000 ед./г биомассы (15 культур) .

Пример 4. 10 мкг parpATER33 и pRHW14» соответственно, в 130 мкл раствора подвергают двойному перевариванию BglII u SphI. Образовавшиеся фрагменты разделяют на 0,8Х-ном агаровом геле, дезоксирибонуклеиновые кислоты элюируют и осаждают. Фрагменты растворяют в 20 мкл буфера ТЕ.

Экспрессионную плазмиду для М /Я интерферона (BgIII) получают путем лигирования 1 мкл большого фрагмента из parpATER33 с 5 мкл малого фрагмента из РИИ14 в 20 мкл среды в: присутствии 5 ед. Т -ДНК-лигазы.

После трансформации Е. coli .НВ101 в микромасштабе выделяют плазмиды нескольких полученных :резистентных к ампициллину клонов и правильность конструкции проверяют двойным перевариванием рестрикционными энэимами

BglII/SphI. Выбирают одну из нлазмид и обозначают как pRH72. E. coli, трансформированный этой плазмидой, имеет фенотип Ар ; Тс

4 мкл большого фрагмента из

pRHW)4 и 5 мкл BglII(2)-SphI-фрагмента из parpATER33, кодирующего

С-конец ф(-интерферона (Аг"), в

20 мкл реакционного раствора лигируют 5 ед. Т -ДНК-лигазы. Образовавшейся плазмидой трансформируют E.

coli HB1D1 и выбирают плазмиду желаемой конструкции. Эта промежуточная плазмида обозначается как pRH77.

С целью комплектования гена для б3,/о/ -интерферона (BglII), удаленный при разрезе рагрАТЕНЗЗс BglII фрагмент следует внести в pRH77. Для этого 10 мкг pRH77 разрезают с BglII в 50 мкл раствора, объем раствора удваивают с помощью 2 буфера CIP (CIP - фосфатаза телячьего кишечника) . 2 K CIP-буфер содержит 100 трис, РН 5»0» 2 мМ хлористый магний I

»

0,2 мМ хлористый цинк, 5 -концевой фосфат добавлением 1 ед. CIP удаляется (60 мин при 37 С) . Линеаризированную форму pRH77 очищают электрофорезом в агаровом геле и элюацией ДНК с последующим осаждением. ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера и 1 мкл полученного раствора вместе с 5 мкл фрагмента с длиной 263 п.о. (BglII

04164 12 (I) Bg1I I (2) -фрагмент), получаемого перевариванием.рагрАТЕВ33 н BglII/

/SphI, в 10 мкл реакционного раствора лигируют в присутствии 5 ед. Т»,—

ДНК-лигазы. Е. coli НВ101 трансформируют и ДНК шести образовавшихся колоний анализируют. Так как концы идентичны введение фрагмента с длиной 263 п.о. может происходить в двух направлениях, плазмиды проверяют относительно правильности конструкции при помощи рестрикционных эндонуклеаз Alul u HaeIII.

Плазмида, в котоРую вставлен

BglII-фрагмент в правильном для экспрессии положении, обозначается как

pRHW78r, а другая с неправильным для экспрессии положением †. как РВН78Й.

20 Е. coli, трансформированный pRH78r или pRH78f, показывает фенотип .Ар", Тс . Трансформированный различными плазмидами штамм Е. cali в 35 мл экспрессионной среды + 20 мкг/мкл ИАК

25 при 37 С выращивают до ОПо„щ 0,6.

Бактерии отделяют центрифугированием.

Осадок бактерий суспендируют в 3,5 мл раствора 50 мМ трис, РН 7,6, и 30 мМ хлористого магния,. охлаждают льдом, обрабатывают ультразвуковым дизентегратором типа Сонипрен-150 при максимальной мощности. Суспензию в течение 10 мин центрифугируют (10000 об/мин

4 С) и надосадочную жидкость стерильно фильтруют. Антивирусную активность раствора определяют с использованием клеток А549, инфицированных вирусом

ЭМК.

Трансформированные pRH72 М / и интерфероном (В8111)бактерии

Е. coli не проявляют антивирусной активности, также как и трансформированный pRH78 штамм E coli кодирующий первые 64 аминокислоты зрелого И -.интерферона и последующий се45 рин

По сравнению с этим результатом

Я /az-интерферон (BglII) проявляет в четыре раза большую специфичную антивирусную активность относитель50 но клеток А549, чем М -интерфер.он (Ар )» причем на 1 л культуры при

ОП 6oogy = 1 клон pRH78r продуцирует приблизительно 30 х10 ед.. интерб ферона.

Al

Пример 5. Очистка Я /Мд-ин" терферона (BglII) .

145 г обработанных кислотой и sa-.

o мороженных при -20 С бактерий Е. со4164 l4

13 160

li клона НВ101/pRH78r в 1450 мл

1Х-ной уксусной кислоты, размешивают, . гомогенизируют в течение 2 мин при 10000 об/мин, добавляют полиамин

P до концентрации 0,25Х и добавлением 5 н. гидроокиси натрия рН среды доводят до 10,0, При охлаждении льдом перемешивают в течение 2 ч и добавлением 5 н. соляной кислоты рН доводят до 7,5. Сырой продукт очищают центрифугированием (3000 об/мин, 60 мин, приблизительно 4 С) .

К сырому экстракту добавляют

430 г/л сульфата аммония и до полного осаждения оставляют стоять в течение 16 ч при 4-8 С ° Осадок отделяют центрифугированием (10000 об/мин, 60 мин, 4-8 С), растворяют в 145 мл

0,01 М хлорида натрия. Значение рН суспензии доводят до 7,5 добавленинием 5 н. гидроокиси натрия. При охлаждении льдом перемешивают в течение 3 ч и затем. раствор центрифугируют до прозрачности (10000 об/мин, 4 С, 60 мин) Диализуют в 0,01 М хлорида натрия до того, пока раствор интерферона не покажет осмолярность

370 осмоль/л.

Двойная хроматография: для очистки хроматографией колонку из целлюлозы

DE-52 уравновешивают 0.,025 M триссоляной кислотой + 0,2 М хлористым натрием, рН 7,5, и подключают к колонне емкостью 60 мл, которая содержит моноклональное антитело EBI-1

1 связанное с сефарозой 4В. Колонка содержит 480 мг моноклонального антитела EBI-1 и уравновешена буфером при помощи триссоляной кислоты +

+ хлористый натрий, рН 7,5. Раствор интерферона пропускают через обе колонки, колонки промывают 0,025 М триссоляной кислотой + 0,2 моль хлористым натрием до того, пока в элюа.те измеряют только экстинкцию оптической плотности при 280 нм ниже

О, 1. Затем отсоединяют содержащую

DE-52-целлюлозу колонку, а колонку,, содержащую антитело, промывают до

ОП при 280 нм в элюате ниже 0,0 1.

Адсорбированный интерферон элюируют

0,1 М лимонной кислотой в 25Х-ном этиленгликоле, собирают пик протеина.

Кислый элюат колонки с антителом доводят до рН 4-5 добавлением 2 н. аммиака и получаемый осадок удаляют центрифугированием. Последней стадией очистки является хроматография на ионите . моно-С. Колонку, содержащую 1 мл

35 ионита, уравновешивают при 0,1 M цйтратом натрия, рН 4,2, наносят ннтерферон и элюируют его градиентом рН (буфер А; О, 1 M цитрат натрия со значением рН 4,2; буфер Б: О, 1 М фосфат натрия со значением рН 8,0) . Интерферон И выходит при значении рН 7,0, пик интерферона собирают.

Пример б. Очистка Сд, -интерферона. а) Экстракция и хроматография с использованием стеклянных частиц, имеющих поры величиной 120-240 меш.

794 r осажденных кислотой и замороженных при -20 С бактерий Е. coli клона pRHN14 при охлаждении льдом перемешивают в 7700 мл 1Х-ной уксусной кислоте до полного распределения материала (около 30 мин) и при помощи

2 н. гидроокиси натрия доводят до рН

10. После перемешивания в течение

2 ч при охлаждении льдом суспензию доводят до рН 7,5 (2 н. соляной кислоты и центрифугируют в течение 1 ч при

10000 об/мин и 4 С. Прозрачную надоо садочную жидкость в количестве 50 мл/ч пропускают через колонну, содержащую

500 мл стеклянных частиц, затем колонну тщательно промывают 0,025 М триссоляной кислотой + 1 M хлоридом натрия (рН 7,5). Адсорбированный интерферон элюируют 50 мл/ч раствора

0,025 M триссоляной кислоты + О, 1 М

KSCN в 50Х-ном этиленгликоле (рН 7,5), Затем пул интерферона подвергают диализу 0,025 М триссоляной кислотой +

+ О, 1 М хлористым натрием, причем добавлением 10Х-ного полиэтиленгликоля с мол.массой 40000 одновременно достигается концентрация пула интерферона. Подвергнутый диализу концентрат осветляют центрифугированием (1 ч, 4 С, 15000 об/мин) . б) Сродственная хроматография на антителе ОМГ-2 на сефарозном носителе.

Очищенное моноклональное антитело

0M1 -2 наносят на сефароэ 4В при помощи активированного брамистым цианом сефароза 4В. При этом используют

16 мг моноклонального антитела на

1 г активированного сефароза 4В. Для разделения используют колонну с объемом 8 мл. Полученный согласно примеру ба концентрат колонны со стеклянныии частицами 4 мл/мин пропускают через колонну с антителом и затем колонну промывают 0,025 М триссоляной кислотой + 0,1 M хлористым натрием, 1604164

РН 7,5. до тех пор, пока в элюате больше не содержится протеина (ОП при 280 нм элюата идентична с плот-< ностью промывного буфера). Затем свя. занный интерферон элюируют О, 1 M лимонной кислотой в 25%-ном этиленгликоле (2 мл/мин) и собирают пик протеина (ОП у gy) в) Хроматография на ионите моно-С, Ионообменную колонну уравновешивают раствором О, 1 N фосфата калия в 25Х-ном пропиленгликоле, РН 6,0

Полученный согласно примеру бб элюат содержащей антитело колонны подают в количестве 0,5 мл/мин. Адсорбиро-. ванный интерферон элюируют при помощи в качестве градиента хлористого натрия (буфер Ь; О, 1 М фосфата калия + 1 М хларистый :натрий, РН 6,0, в 25Х-ном пропнленгликоле) . Фракции (по 1 мл) исследуют в отношении интерфероновой активности. Первый пик (011ggo >>) при применении 46х буфера

Б содержит C0q -интерферон. г) Жидкостная хроматография под давлением с исгользованием обращенной Фазы.

В качестве неподвижной Фазы служит колонна типа ВП-РП 18, 4х250 мм, содержащая пористые частицы диаметроя 5 мкм и величиной пор 300 K. В качестве подвижной фазы служит градиент ацетонитрила в О, 1%-ной трифторуксусной кислоте. Буфер А: О, 1Х-ная трифторуксусная кислота в воде; буфер B 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле.

Градиент 20-68%. буфера В в тече-. ние 28 мин, Скорость подачи 1мл/мин.

Детекция ОП2,1 . Через колонну пропускают 630 мкг полученного согласно примеру бв протеина (пул интерферона после хроматографии на моно-С) . Элюат в области 48-58% буфера Б анализируют. Интерферон элюиру" ют 24,5 мин с 63Х буфера. Выход составляет 5-10 мкг, а удельная активность ) 10 ед/мг протеина. д) .Определение последовательности

N-концевых- аминокислот.

Полученный согласно примеру бб пик Я, -интерферона сушат в центРифуге с последующим анализом. ПолуЧают следующую последовательность аминокислот:

ХХх-Asp-Leu-Pro-G lu-Asr:-Ххх-Clu-Leu1

Leu-Se r10

Эта последовательность подтверждает последовательность аминокислот по кДНК (цистеин в положении 1 не

5 может быть доказан без восстановления и алкилирования протеина, а гистидин в положении 7 не может быть однозначно доказан. е) Очистка гибридного И,/М -интер10 ферона (табл.1-3) .

Формула изобретения

С пособ получения гибридного интерферона типа И / М, заключающийся в том, что плазмиду рагрАТЕКЗЗ обрабатывают рестриктазами HindIII u

amHI, выделяют фрагмент размером

750 п.о., лигируют данный фрагмент с помощью Т -ДНК-лигазы и ВашНХHindIII-фрагмент размером 800 пор. оснований плазмиды pRHW11 или pRHW12, полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в штамм Е. coli HB101 выделяют плазмиду pRHW13 или pRHW14, лигируют BglII-SphI-фрагменты плазмиды pRHW13 или pRHW14 размером

3,77 кВ с помощью Т -ДНК лигазы и фрагмент размером 1,18 кВ, кодирующий С-конец интерферона плазмиды

parpATER33, полученную рекомбинант30 ную ДНК трансформируют в штамм Е. co. li НВ101, выделяют плазмиду pRH77, обрабатывают плазмиду pRH77 BglII очищают линеаризованную форму плаз" миды pRH77 и легируют ее с помощью

Т4-ДНК-лигазы с BglII-SphI-фрагментом длиной 0,26 кВ плазмиды parpATER

33, полученную рекомбинантную ДНК трансформируют в штамм бактерий E.

coli 101, выделяют плазмиду pRHW78r

40 трансформируют штамм. E. cali НВ101 плазмидой pRHW78r, выращивают трансформированный штамм, очистку белка проводят путем осаждения с помощью

10 мл 1Х-ной уксусной кислоты, гомогенизации полиэтиленимином до концентрации 0,25Х, доведением РН среды до

10 с помощью 5 н. гидроокиси натрия с последующим снижением РН до 7,5 с помощью 5 н. соляной кислоты и вне50. сением в получаемый сырой экСтракт

43% сульфата аммония, центрифугироФ ванием диализом до осмолярности

370 смоль/л, хроматографией на целлюлозе DE-52, затем на связанной с моноклональным антителом EBI-1 ! сефарозе 4В, доведением РН элюата до 4,5, центрифугированием, хроматографией на моно-С и элюацией при

РН 7.

1604164

17 18

Таблица1

Экстракция и хроматография с использованием стеклянных частиц (ХСЧ) с порами величиной 120-240 Mem с

М

Протеин Единиц мг

Выход, Х

Интерферон ед

Продукт

Объем, 7700 190 ° 10 19100 9950

100

425 53 10

4600 11500

1650 27300

45 10

410

Таблица 2

Сродственная хроматография на антителе ОМГ-2 на сефарозном носителе

«к

Протеин Единиц мг

Объем Интерфе1 мл рон", ед

Материал

40,6 10 1520

26700

100

Подано 350

Не адсорбировано 440

Элюат, содержащий ц-интерферон 7

4,5 ° 10

9,0 10 63

25, 6 ° 10 2,84

Таблица3

Интерферон+

1 ед

Материал Объем, Выход, Ж

7,14 10

284 25 10 100

Подано 7

Пул, содержащий Q -интерферон 2

4,2 10 43

3,04 10 О, 72

Ф

Определение содержания интерферона осуществляют, измеряя антивирусную активность при помощи клеток

А549, инфицированных вирусом ЭМК, с использованием в качестве стандарта М -интерферона. (Ap ) . указанное значение представляет собой среднее значение трех независимых опытов.

Определение протеина осуществляют с использованием в качестве стандарта альбумина сыворотки.

Сырой экстракт

Пул после . ХСЧ

После диализа

Хроматография на ионите моно-С т

Единиц

Протеин, мг