Способ получения растений-регенерантов чая

 

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться для ускоренного получения большого количества растений чая. Целью изобретения является ускорение получения регенерантов и повышение их выхода . Способ состоит в том, что регенеранты чая получают на питательной среде, за основу которой взята пропись Гамборга Вз при строгом соблюдении режимов культивирования , чередования световой и темковой фазы и фитогормонн.-;х добавок. 3 :5л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s А 01 Н 4/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4433735/13 (22) 31.05.88 (46) 23,01,91. Бюл, N 3 (71) Всесоюзное научно-производственное объединение по чаю и субтропическим культурам и Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР (72) И.А.Вечернина, В.В,Кутубидзе, О.К.Таварткиладзе и В,А.Кунах (53) 578,085,23 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1311673, кл, А 01 Н 3/00, 1985.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и семеноводстве (в частности, в работе по созданию искусственных семян), в исследованиях по физиологии, эмбриологии и морфогенезу растений.

Цель изобретения - ускорение получения регенерантов и повышение их выхода.

Способ состоит в том, что недозрелые коробочки с семенами чая стерилизуют путем погружения на 3 — 5 с в 96 этиловый спирт с последующим обжиганием в пламени спиртовки, в асептических условиях проводят снятие наружных покровов с семени, вырезают половой зародыш, каждую семядолю разрезают на четыре фрагмента и помещают на искусственную агаризованную питательную среду(0,5 — 0,6;4-ный arao), содержащую макро- и микроэлементы по прописи Гамборга ВБ и дополненную 6-бенэиламинопурином (2 мкмоль) и а-нафтилуксусной кислотой (10 мкмоль), Культуральные сосуды с эксплантатами помещают в усло... Я2„„1621825 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ вЂ” РЕГЕНЕРАНТОВ ЧАЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может применяться для ускоренного получения большого количества растений чая. Целью изобретения является ускорение получения регенерантов и повышение их выхода, Способ состоит в том, что регенеранты чая получают на питательной среде, за основу которой взята пропись Гамборга В5 при строгом соблюдении режимов культивирования, чередования световой и темновой фазы и фитогормонн;.:,х добавок, 3-::бл. вия темноты и инкубиру.от при 25 -l C в течение 15 сут. затем переносят в условия освещения: освещенность 2 — 4 лк, фотопериод 16/8 ч, температура та же, Через 30-40 сут из зксплантата разви,ается быс;рорастущая эмбриогенная каллусная масса.

Помещая змбриогенный каллус на ту же среду, но с уменьшенным вдвое содержанием регуляторов роста, через 15 — 20 сут наблюдают образование соматических эмбриоидов, которые в процессе своего развития проходят все стадии, присущие развитию зиготических зародышей: глобулярную, сердечковидную торпедовидную и семядольную. Рмбриоиды на семядольной стадии развития помещают на 1/2 состава среды Гамборга ВБ, дополненную 1 мкмоль 6-бензиламинопурина и

5 мкмоль р -индолилмасляной кислоты, культивируют в тех же условиях освещения.

Наблюдают развитие у соматических эмбриоидов корней и побегов. Через 30-35 сут образуются проростки чайных растений, которые" переносят s почву.

1621825

10

За один цикл выращивания из эмбриогенного каллуса, полученного от одного фрагмента семядоли, формируется 30 — 50 соматических эмбриоидов, 80-90 которых последовательно развивается в растения. С целью увеличения коэффициента размножения участки семядоль от соматических змбриоидов повторно культивируют при тех же условиях, получая каллусную массу, а затем и соматические эмбриоиды, развивающиеся в растения, Пример 1. Зеленые коробочки с недозрелыми семенами чая сорта Грузинский Кг 2 подвергают поверхностной стерилизации, погружая их в 96 этиловый спирт, обжигают D пламени спиртовки. Такой l1pMем поверхностной стерилизации позволяет получить 100%-ный выход неинфицированного материала при 100-ном сохранении его жизнеспособности, В асептических условиях удаляют с семян наружные покровы, извлекают семена и вырезают половой зародыш, каждую семядолю делят на четыре фрагмента и эти фрагменты помешают на агаризованную среду Гамборга В5, дополненную сахарозой (3%) витаминами; никотиновой кислотой 1 мг/л, гиамином 10 мг/л, пиридоксином 1 мг/л, мезоинозитом 100 мг/л;

6-бензиламинопурином 1 — 20 мкмоль, Q-нафтилуксусной кислотой 2 — 20 мкмоль, рН среды до автоклавирования доводят до 5,8 — 5,9, Условия культивирования: инкубирование эксплантатов в первые 15 сут в темноте при

25+1 С, а затем в условиях освещения при

2 — 4 лк, фотопериоде 16/8 ч. Более длительное пребывание эксплантатов в условиях темноты приводит к частичной потере эмбриогенного потенциала каллуса, а при помещении эксплантатов сразу в условия освещения полностью ингибируется развитие эмбриогенного каллуса.

Дальнейшее развитие соматических эмбриоидов происходит более синхронно и за меньший промежуток времени на среде с уменьшенным вдвое содержанием регуляторов роста.

Соматические змбриоиды на семядольной стадии развития помещают на 1/2 состава среды Гамборга Вь, дополненную

1 мкмоль 6-бензиламинопурина и 5 мкмоль

Р-индолилмасляной кислоты. Использова15

50 ние полного состава среды Гамборга В приводит к опережению роста и развития побега над корнем, кроме того, корень растет в основном в длину и не формирует боковых ответвлений.

Растения-регенеранты переносят в почву, укрывают в течение 15 — 20 дней полиэтиленовой пленкой, а после этого выращивают в обычных условиях.

Пример ы 2 и 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, отличие состоит в том, что действие подтверждается исследованиями на других сортах чая, а именно

Колхида и Китайская крупнолистная форма.

Влияние концентрации регуляторов роста в индуктивной среде Гамборга В5 . :а характер ответа эксплантатов (при n =- 40) представлено в табл, 1, влияние концентрации регуляторов роста на темп развития соматических эмбриоидов до семядольной стадии — в табл. 2, влияние концентрации регуляторов роста в 1/2 состава среды Гамборга Вь на характер формирования проростков чайного растения из соматических эмбриоидов на семядольной стадии развития — в табл, 3, Формула изобретения

Способ получения растений-регенерантов чая, включающий введение эксплантатов в культуру, культивирование на питательной среде с последующим получением регенерантов, о т л v ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения получечия регенерантов и повышения их выхода, в качестве зксплантатов используют семядоли из недозрелых семян, культивирование осуществляют на модифицированной среде Гамборга Вь, в которую вносят 2 ммоль 6-БАП и

10 ммоль а-НУК, при следующих режимах. первые 15 сут его проводят в темноте, далее культивирование осущес. вляют на свету для индуцирования эмбриогенного каллуса, который помещают на ту же среду с уменьшенной вдвое концентрацией используемых регуляторов роста для получения соматических змбриоидов до с мядольной стадии развития, после чего их переносят на среду Гамборга Ви с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей, в которую дополнительно вводят 1 ммоль 6-БАП и

5 ммоль P -_#_MK.

1621825

Таблица 1

Грузинский М 2

ККФ Колхида

Концентрация регулято ов оста, мкмоль

Ответившие, Ответившие, БАП

Ответившие, НУК

Характер ответа

Характер ответа

Характер ответа

Кн

K3,KH

Кэ, P

Кэ, P

Кэ, Кн, P

Кэ, Кн, P

Кз, Кн

Кн,ЭП,Р

Кн,ЭП,Р

П р и м е ч а н и е. БАП вЂ” 6 — бензиламинопурин; НУК вЂ” й- нафтилуксусная кислота;

Кн — каллус неэмбриогенный; Кэ — каллус эмбриогенный;

P — ризогенез; ЭП вЂ” эмбриоподобные структуры.

Таблица 2

Продолжительность развития, нед.

Концентрация регуляторов оста, мкмоль

Соматические эмбриоиды

Сорт

6 — бензиламинопурин

Общее количество, шт.

Развившиеся до семядольной ста ии, a — нафтилуксусная кислота

Грузинский М2

Колхида

Крупнолистная китайская форма

Таблица 3

1

2

4

20

10

2

4

2

4

37,5

Кн

Кэ,Кн

Кз,Кн, P

Кз, Кн

Кэ,Кн,Р

Кз, Кн

Кэ, Кн

Кн, ЭП

Кн, ЭП

20

12,5

36

41

43

38

38

51

44

32

Кн

Кэ,Кн

К3, Кн

Кэ, Кн

Кз, Кн, Р

Кэ, Кн

K3, KH

К3, Кн

Кн, ЭП

16,7

61,0

83,5

42,1

10,0

44,7

80.,4

61,1

25,0

44,4

85,7

48,7

8 — 9

3 — 4

2 — 3

4-5

8 — 9

3-4

2 — 3

4 — 5

8 — 9

3 — 4

2 — 3

4 — 5