Плазмида p74, определяющая синтез микроцина, и штамм бактерий escherichia coli, обладающий антибактериальной активностью

 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека. Целью изобретения является расширение спектра антагонистического действия штамма. Получена плазмида р 74, определяемая синтез микроцина с широким спектром действия, путем передачи плазмиды р 1 из клеток Enterobacter sp. в клетки E. coli С600 с помощью мобилизации неконъюгативной плазмиды RSF 1010 и введения в природную плазмиду р1 транспозона Tn 5, детерминирующего устойчивость к канамицину. Плазмиду р74 трансформируют в клетки E. cori М 17 для получения штамма E. coli М 17 (р 74) с широким спектром антагонистического действия. В результате получают штамм, проявляющий анатгонистическое действие против болезнетворных бактерий различных таксономических групп, как то Escherichia coli, Salmonella, Shegella, Pseudimonas, Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Bacillus megaterium, Bacillus pumilis. Штамм проявляет антагонистическую активность in vivo, безвреден для лабораторных животных и телят. 1 з. п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для профилактики кишечных заболеваний и коррекции микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и человека. Целью изобретения является расширение спектра антагонистического действия штамма. Для этого получена плазмида р74 путем передачи из клеток Enterobacter sp. природной плазмиды р1, определяющей синтез микроцина в клетке E. coli C600 c помощью мобилизации неконъюгативной плазмиды RSF 1010, и введения в природную плазмиду р1 транспозона Тn 5, детерминирующего устойчивость к канамицину. Причем штамм Enterobacter sp. , синтезирующий микроцин, выделяют в результате скрининга 4200 изолятов кишечных бактерий, полученных из фекалий 30 здоровых детей, конкретно - из микрофлоры фекалий здорового ребенка 6 лет. Процедура определения активности микроцина описана в примере 3. При скрининге в качестве индикаторного штамма используют Escherichia coli B. Плазмида р74 имеет следующие характеристики: Молекулярная масса 57 Мg (определена как сумма мол. масс фрагментов, полученных при действии рестриктаз). Конъюгативна - передается в клетки Е. coli C600 с очень низкой частотой (<1˙10^-8) на клетку донора. В клетках штамма E. coli C600 присутствует в количестве 1-2 копий на клетку. Определяет: - устойчивость к канамицину (200 мг/мл); - синтез микроцина; - устойчивость к продуцируемому ею микроцину. В клетках штамма E. coli C600 и М17 поддерживается стабильно внеселективных условиях. Не влияет на скорость роста и морфологию клеток Е. coli C600 и М 17. При трансформации клеток Е. coli C600 плазмидной ДНК р74 образуется 10² трансформантов на 1 мкг ДНК. Для получения штамма Е. coli М 17 (р74) штамм Е. coli М 17 (р74) штамм Е. coli М 17 трансформируют плазмидой р74 и отбирают клоны, устойчивые к канамицину и способные синтезировать антибиотик. Штамм Е. coli М 17 (р74) характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Грамотрицательные, неспорообразующие, подвижные палочки с закругленными концами. Размеры клеток (1,1-1,5)х(2,0-5,0) мкм. Культуральные признаки. Клетки штамма хорошо растут на простых питательных средах - мясопептонном агаре, агаризованном бульоне Хоттингера, минимальных средах с глюкозой, глицерином. При выращивании в жидком бульоне Хоттингера или МПБ при росте 1 сут (37^оС) дают равномерное помутнение бульона. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера и МПА образуют серовато-желтоватые округлые колонии (иногда с фестончатыми краями); на среде Эндо образуют красные с металлическим блеском колонии (1-2 сут, 37^оС). Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Температурный оптимум при росте на бульоне Хоттингера или МПБ 37^оС. Расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, рамнозу, арабинозу, маннит, инозит, очень слабо утилизирует сорбит. Не утилизирует цитрат натрия и малонат натрия. Урезная активность отсутствует. Сероводород не образуется. Синтезирует β -галактозидазу. Образует индол. Не синтезиpует фенилаланиндезаминазу. Желатиназная активность отсутствует, молоко сбраживает. Активность лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы обнаруживается. Аргининдегидролаза отсутствует. Штамм принадлежит к серологическому типу 02: К1 (L): II6. Отсутствуют адгезионные антигены К88, К99, F41, Att25, 987Р. Штамм устойчив к канамицину (100-200 мкг/мл). Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года. Клетки, выросшие на косяках с агаризованным бульоном Хоттингера в течение 1 сут, смываются раствором для лиофилизации следующего состава: 1 мл физиологического раствора +1 мл смеси (10 мл сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта +1 мл раствора сахарозы 30 г- 30 мл). Штамм депонирован в коллекции ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича под номером 186. П р и м е р 1. Получение плазмиды р74. Введение плазмиды RSF 1010 в природный штамм Enterobacter sp. Плазмиду RSF 1010, определяющую устойчивость к стрептомицину (100 мкг/мл), передают в природный штамм Enterobacter sp. по методике трансформации компонентных клеток. Ночную культуру штамма разводят в 100 раз средой LB, подращивают до середины логарифмической фазы роста. Клетки в объеме 40 мл осаждают центрифигурованием, промывают 0,14 М NaCl, суспендируют в 2 мл 50 мМ СаСl₂, инкубируют в ледяной бане 20 мин. К 50 мкл компетентных клеток добавляют 10 мкл ДНК RSF 1010 (в концентрации 0,1 мг/мл) и инкубируют 40 мин в ледяной бане. После температурного шока (42^оС, 3 мин) клетки разводят в 0,5 мл среды LB и инкубируют с аэрацией в течение 1-1,5 ч при 37^оС. Высев клеток производят на агаризованную среду LB со стрептомицином (100 мг/мл) и инкубируют 1 сут при 37^оС. Выделение плазмидной ДНК. Клетки из ночной культуры клонов Enterobacter sp. , устойчивых к стрептомицину, осаждают центрифугированием, суспендируют в 1 мл раствора А (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, рН 8, 0,25 мМ трис-НСl, рН 8,0, лизоцим 2 мг/мл), добавляют 2 мл раствора В (1% SDS, 0,2 N NaOH), осторожно перемешивают, добавляют 1,5 мл ЗМ ацетата Na (рН 4,8), выдерживают 1 ч при 0^оС. Смесь центрифугируют 20 мин при 16000 об/мин, к супернатанту добавляют изопропиловый спирт (0,6 от исходного объема смеси). Осадок промывают 70^о этанолом, подсушивают и растворяют в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НСl, рН 8, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Образцы анализируют в 0,7% агарозном геле в ТВЕ-буфере (50 мМ трис-борат, 4 мМ ЭДТА, рН 8,0). Клоны, содержащие плазмидные ДНК разных молекулярных масс, одна из которых соответствует молекулярной массой RSF 1010, используют для совместной передачи плазмид при конъюгации. Мобилизация плазмиды RSF 1010 плазмидой р1 при конъюгации. Донорный штамм Enterobacter sp. (р1, RSF 1010). Реципиентный штамм Е. coli С 600 nal²El². Ночную культуру донорного и реципиентного штаммов разводят средой до оптической плотности 0,1 (СФ, 560 нм), инкубируют с аэрацией до достижения экспоненциальной фазы роста. На чашку с агаризованной средой наносят по 0,1 мл донорного и реципиентного штамма и инкубируют 1 сут при 37^оС. Выросшие клетки смывают физиологическим раствором и высевают на агаризованную среду с налидиксовой кислотой (100 мкг/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) из серии 10-кратных разведений. Отбирают клоны, устойчивые к налидиксовой кислоте и стрептомицину, синтезирующие микрофин и содержащие 2 плазмиды. Введение транспозона Тn 5 в природную плазмиду р1. Ночную культуру штамма С600 (RSF 1010, р1) разводят средой LB до оптической плотности 0,1 (СФ, 560 нм), инкубируют с аэрацией до плотности 0,8, осаждают центрифугированием (4500 об/мин), 10 мин, суспендируют в прежнем объеме средой LB с MgCl₂ (0,01 М). К 0,1 мл клеток добавляют 0,1 мл суспензии фага λ: Tn 5 (титр фага 5,0˙10⁸ед. /мл), инкубирают с аэрацией 20 мин при 30^оС, добавляют 0,2 мл среды LB+MgCl₂, инкубируют еще 20 мин при 30^оС. Клетки высевают на чашке с агаризованной средой LB с канамицином (200 мг/мл), растирая шпателем, и растят 1 сут. Выросшие колонии смывают физиологическим раствором и выделяют плазмидную ДНК (как описано выше). Плазмидной ДНК трансформируют клетки штамма Е. coli С600 str^s. Отбор клонов ведут по устойчивости к канамицину (200 мг/мл) и чувствительности к стрептомицину (100 мг/мл). В результате отбирают клон Е. coli, содержащий плазмиду р1: : Tn 5 (названную р74), и не содержащий плазмиды RSF 1010. П р и м е р 2. Получение штамма Е. coli М17 (р74). Из клеток отобранного клона Е. coli С600 (р74) выделяют плазмидную ДНК и трансформируют его клетки Е. coli М17. Отбирают клоны, устойчивые к канамицину (100 мкг-мл) и способные синтезировать микроцин. Клетки рассеивают два раза до отдельных колоний на среде с канамицином и проверяют на прототрофность, способность синтезировать микроцин и наличие плазмиды р74. Штамм, проявляющий эти признаки, называют Е. coli М17 (р74). П р и м е р 3. Изучение антагонистических свойств описываемого штамма. Для оценки антагонистического действия клетки штамма высевают уколом на чашки с агаризованной средой и выращивают 2 сут при 37^оС. Выросшие колонии убивают парами хлороформа, после чего поверхность среды заливают вторым слоем - 3 мл 0,7% агаризованной среды того же состава, смешанной с 0,1 мл индикаторной культуры, выросшей до экспоненциальной фазы роста (1-3˙10⁸ кл/мл) на качалке в жидкой среде того же состава. Вокруг колоний штамма в этих условиях образовываются прозрачные зоны подавления роста чувствительных штаммов от 5 до 40 мм в диаметре. Оптимальная активность штамма проявляется на минимальной солевой среде (г/л дистиллированной воды); NH₄Cl 1 г; КН₂РО₄ 1,5 г; Na₂НРО₄ 3,5 г; МgSO₄ 1,0 г; агар (Дифко или Феррак) 1,5; глюкоза 0,2% ; дрожжевой экстракт (Дифко) 0,3% ; рН 7,0-7,5. Штамм выделяет вещество с антибактериальным действием, диффундирующее через целлофан и чувствительное к протеазам. Штамм проявляет антагонистическую активность против E. coli: действует на 68 изученных в этом отношении штаммов Е. coli различного происхождения, в том числе 39 штаммов-возбудителей колибактериоза сельскохозяйственных животных Shigella, Salmonella, Proteus, Cirtobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Aeruginosa, Erwinia, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus. В таблице приведены результаты одного из опытов по действию штамма Е. сoli М17 (р74) на различные бактериальные штаммы. П р и м е р 4. Изучение вирулентности и приживаемости штамма в организме лабораторных животных и телят. Штамм не вызывает гибели белых мышей с массой 16-20 г при введении им подкожно 10⁹ клеток, а также при введении внутрибрюшинно 5˙10⁸ клеток. При пероральном введении штамма 7-дневным крысятам-сосункам (5˙10⁸), а также при анальном введении 3-дневным мышатам-сосункам (2-5˙10⁸ клеток) установлена его безвредность. При вскрытии животных не обнаруживается макроскопически и микроскопически каких-либо воспалительных или дистрофических изменений в кишечнике; в то же время исходный штамм Е. coli М17 вызывает явления энтерита, приводящего к гибели части испытуемых животных. Штамм не продуцирует термолабильный и термостабильный энтеротоксины. Установлена хорошая приживаемость штамма в кишечнике крысят-сосунков: клетки выделяют из кишечника крысят на протяжении 14 дней (срок наблюдения) в количестве 1,4˙10⁷-2˙10⁸ бактерий/г. Штамм безвреден для телят при пероральном введении и не вызывает у них патологических изменений. Бактерии сохраняют жизнеспособность в кишечнике телят в течение 6-8 дней. П р и м е р 5. Изучение антагонистического действия описываемого штамма in vivo. Показано, что предварительное пероральное введение штамма Е. coli М 17 (Р74) крысятам-сосункам (5˙10⁸ клеток) защищает их против энтеротоксигенного штамма Е. coli K88 (то же количество клеток), вызывающего 100% гибель испытуемых животных. Животные, получавшие штамм Е. coli М17 (р74) за сутки до введения штамма К88, остаются живыми и не проявляют никаких болезнетворных изменений. При высеве содержимого их кишечника клетки штамма К88 не обнаруживаются. Полученный штамм может быть использован для профилактики кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и человека. Кроме того, штамм может быть использован как источник получения нового вещества с антибактериальным действием широкого спектра. Таким образом, получен штамм, обладающий антагонистической активностью против широкого круга энтеробактерий: Е. соli (68 штаммов различного происхождения, в том числе 39 штаммов - возбудителей колибактериоза сельскохозяйственных животных); Salmonella (19 видов), Shigella flexneri; Proreus rettgeri и mirobilis; Citrobacter freundei, Klebsiella ozaenea; кроме того, оказывает действие на один штамм Pseudomonas aeruginosa, а также слабое действие на Erwinia, Bacillus megaterium и Bacillus pumilus. (56) Biochem. Biophys. Res, Communs, 1976, v. 69, p. 7-14.

Формула изобретения

1. Плазмида p74, определяющая синтез микроцина, мол. м. 54,7 Мд, содержащая: ДНК плазмиды p1 штамма Enterobacter sp. ; траспозон Tn 5; при расшеплении рестриктазой Bg1 11 образуются 12 фрагментов с размерами 21; 12; 7,8; 7,0; 6,8; 5,8; 5,3; 3,8; 2,6; 2,5; 2,2; 2,1; т. п. н. ; - при расщеплении EcoRI-7 фрагментов с размерами 25, 23, 14, 9,6; 6,0; 2,3; 0,8 т. п. н. - при расщеплении CIaI - II фрагментов с размерами 14,5; 13; 9,6; 9,0; 8,2; 6,8; 6,0; 5,8; 4,8; 3,4; 3,2 т. п. н. ;
- при расщеплении HindIII - 9 фрагментов с размерами: 25; 15; 14; 13; 6,2; 3,4; 2,7; 2,4 т. п. н. ;
- при расщеплении PwII - 11 фрагментов с размерами 23; 13; 9; 6,5; 5; 4,8; 4,2; 4; 3,8; 3,4; 3,2; 2,6 т. п. н. ;
- при расщеплении SalGI - 7 фрагментов с размерами 25; 23; 19; 11; 7,8; 5; 3,8 т. п. н. ;
- гены синтеза микроцина, устойчивости к микроцину, устойчивость к канамицину (100 мкг/мл);
- конъюгативна - передается в клетки E. coIi с очень низкой частотой; меньше 1 · 10⁸ на клетку донора;
- в клетках E. coli присутствует в количестве 1 - 2 копий на клетку;
- в клетках штаммов E. coli поддерживается стабильно в неселективных условиях в течение не менее 100 генераций;
- не влияет на скорость роста и морфологию клеток E. col i;
- при трансформации клеток E. coli C600 образует 10² трансформантов на 1 мкг ДНК. 2. Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК N 186, обладающий антибактериальной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000

Извещение опубликовано: 20.03.2000        

---