Способ определения токсичности зернопродуктов и комбикормов

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в кормопроизводстве, в частности в определении токсичности зерна, различных продуктов его переработки, комбинированных кормов, пораженных И зобретеиие относится к биотехнологии и может быть использовано в области кормопроизводства, в частности в определении токсичности зерна, различных продуктов его переработки, комбинированных кормов, пораженных микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (микотоксииы). Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение длительности.j микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (микотоксины). Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение длительности. Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментный препарат глкжоамилазы - глюконигрин Г20х, который инактивируется в различной степени при инкубировании с экстрактами из токсичных кормов. Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилазы - глюконигрина Г20х под действием как очищенных чистых препаратов микротоксинов , так и экстрактов из кормовых средств, инфицированных микроскопическими грибами и содержащих микотоксины. Инкубирование экстрактов микотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42°С в течение 10-15 мин, а о токсичности судят по снижению активности фермента. Продолжительность анализа 3-4 ч. 2 таблЛ о Ј (Л Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментньй препарат глюкоамилазы - глюконигрин Г20х, который инактивируется в различной степени при инкубировании с экстрактами из токсичных кормов. . Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилазы - глюконигрина Г20х под действием как очищенных чистых препаратов микотоксинов, так и экстрактов из кормовых средств, инфицированных о Ј 00 00 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСГ1УБЛИН (51)5 С 12 1/40

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,, Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4417488/13 (22) 18.02.88 (46) 15.04.91. Бюп. Р 14. . (71) Всесоюзное научно-производственное объединение комбикормовой про-. мышленности "Комбикорм" (72) В.Г.Артюхов, А.С.Воробьева, Т.A.Ковалева, В.К.Кокин, В.Ф.Селеменов и Г.А.Чикин (53) 576,8.09 7.29 (088.8) (56) Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В.

Методы определения активности гидролитических ферментов. М,: Легкая промьнипенность, 1981, с. 287.

Тутельян В.А., Кравченко Л.В.

Микотоксины. М.: Медицина, 1985. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ

ЗЕРНОПРОДУКТОВ И КОМБИКОРМОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в кормопроизводстве, в частности в определении токсично ти зерна, различных продуктов его переработки, комбинированных кормов, пораженных

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в области кормопроизводства, в частности в определении токсичности зерна, различных продуктов его переработки, комбинированных кормов, пораженных микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (микотоксины).

Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение длительности. 1..SU„„1641888 А 1 микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (микотоксины) . Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение длительности. Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментный препарат глюкоамилазы — глюконигрин Г20х, который инактивируется в различной степени при инкубировании с экстрактами из токсичных кормов. Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилазы — глюконигрина Г20х под действием как очищенных чистых препаратов микротоксинов, так и экстрактов из кормовых средств, инфицированных микроскопическими грибами и содержащих микотоксины. Инкубирование экстрактов микотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42 С в течение 10-15 мин, а о токсичности судят по снижению активности фермента. Продолжительность анализа 3-4 ч. 2 табй.

Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментный препарат глюкоамилаэы — глюконигрин

Г20х, который инактивируется в pasличной степени при инкубировании с экстрактами иэ токсичных кормов.

Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилаэы — глюконигрина Г20х под действием как очищенных чистых препаратов микотоксинов, так и экстрактов из кормовых средств, инфицированных

1641888

50 микроскопическими грибами .и содержащих микотоксины. Инкубирование экстрактов микотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42 С в течение 10о

15 мин, а о токсичности судят по снижению активности фермента. Продолжительность анализа 3-4 ч. .„Пример. К .навеске измельченного зерна, продуктов его переработки (отруби, мучки) или комбикорма массой 50 г приливают 150 смз ацетона, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу, куда добавляют 50 см гексана и 100 см

17-ного раствора NaC1, Содержимое колбы перемешивают в течение 1 мин, а затем выпивают в делительную воронку. После расслоения жидкости 20 верхний (г ексановый) слой отбрасывают, а нижний (водно-ацетоновый) переносят в другую делительную воронку и экстрагируют токсические вещества хлороформом трижды (50» 20, 20 см ) .

Хлороформные экстракты объединяют, пропускают через фильтрат с безводным сульфатом натрия и выпаривают в выпарительной чашке на водяной бане (50-60 С) досуха. Сухой остаток ацетоном количественно переносят в мерную ко3тбу взаимностью 50 см и доводят до метки.

0 токсичности исследуемого экстракта судят по изменению активности глюкоамилазы — глюконигрина Г20х при добавлении в инкубируемый раствор

1 см экстракта ° К контрольному раствору добавляют 1 см чистого ацетона.

Активность глюкоамилазы определяют приятным глюкозооксидазным методом, основанным на специфическом определении глюкозы, образующейся при действии глюкоамилазы на раство45 рймый крахмал.

Активность глюкоамилазы в пред- лагаемом способе при воздействии экстракта из корма определяют следующим образом. К 10 см 17-ного раствора крахмала, нагретого до 42 С, приливают 5 см раствора глюкоамилазы и 1 см экстракта исследуемого корма, инкубирают смесь в термостате. при 42 С в течение 15 мин. Через

15 мин отбирают 1 см гидролизата и кипятят 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, вносят

3 смз раствора С согласно действующей методике, перемешивают, оставляют на 45 мин при комнатной температуре и в дальнейшем определение проводят согласно пейстя ющему глюкозооксидазному методу.

Для определения чувствительности и достоверности значения нижнего ! предела снижения активности глюконигрина Г20х проведена метрологическая оценка полученных данных, Снижение активности тест-объекта — глюконигрина Г20х достоверно устанавливается при концентрации глюконигрина от

"3

10 М и исследуемых микотоксинов

-8 от 3,0 10 М, при этом отсчет определения токсичности производится с 207. потери активности фермента — деградации молекулы глюконигрина от действия токсического фактора, Сравнительная характеристика известных и предлагаемого методов определения токсичности и их пороговая г чувствительность приведена в табл. 1.

Из данных табл. 1 следует, что при действии экстрактов из кормов, зараженных продуцентами токсинов

Т-2, Ф-2, охратоксина А, афлатоксина

Б< активность глюкоамилазы достоверно снижается на 42, 29, 37 и 327. соответственно.

Предлагаемый способ определения токсичности определяет присутствие микотоксинов в концентрации 10 10 мкг/пробу, что подтверждает значительно большую чувствительность предлагаемого способа, чем используемые в настоящее время биометоды.

Лля сравнения существующих методов с предлагаемым готовили пробы доброкачественного зерна, зерноотходов, комбикорма и такие же пробы, но содержащие определенное количество искусственно зараженного токсигеиными грибами-продуцентами токсинов

Т-2, Ф-2,.охратоксина А и афлатоксина В1 корма, которые были исследованы на токсичность (см. табл. 2) .

Из данных табл. 2 следует, что молекула глюкоамилазы - глюконигрина

Г20х достоверно уменьшает каталитическую активность при действии экстрактов зараженных микотоксинами кормов — до 847. от исходной, что может, служить тестом для определения токсичности. При понижении активности фермента от 207, н более пробы комбикорма или зернопродуктов считаются токсич ными.

1888 6 инкубацию их с тест-объектом с последующей оценкой токсичности, о т— личающийс я тем,что,сцелью повышения чувствительности и сокращения длительности, в качестве тест-объекта используют фермент глюкоамилазу-глюконигрин Г20х в концентрации 10 -10 М, инкубацию про-7 -4 водят при 38-42 С в течение 1015 мин, а оценку проводят по снижению активности фермента.

Таблица !

1!араговая чувствительность различима метакса определения токсичности

Ократакснн Л

16гггCTOKCIIII C-2 6IXaTOXCIIII t-2

Тест-объекты Длительность анализа, Еанпентра- Оиенкз ч пия B:IKcT таксич рзкте ности

24 4,20/21,0

Оценка

Концентрация в экстракте

IinIIIlceTpaпия Оценка п экстракте токснчк насти

0lleIlI а таксичКои пг. итра пил

ll зкстрчкте е такснч— пасти насти

Качест- 72,0/360 венная токснч30,10/150,5 Качссг- 6.,00/325 венная токсггч 1ачествеиная, токснч

Качсст

Рыбы гуппи венная токснчио ио но но

Белые мьювг: перорально поцконна виутрибрююинно

Кролики (конная проба) 315 О/787гО Та лс

400,0/1000

400,00/1500,0

43ч,00/1085,0

Та яс

720 00/1800 О

468,00/1170,0

То ье

12, О/30,0

4,50/11,2

То ке

72

129,0/325,0 -"- 62, О/1 55, О

4 5,0I 112,0

4,50/11,2

7 сут нли 168 ч 1,00/5.0

1, ОО/5, О

Не определяется

Токсич1.16/5,8 но

29, 107145, 5

О, 255/1, 25

Клетки ХАО (известный)

Разработанный ферментггый метод

0,t81/0,95 .зг

3,75 10 /

/7,5 10

0,099/0,4 5

1,0 In /2 10

322 сиикение активности

372 спивание активности

292 сниPIC IIII C активности

4 Х PICIченггc

4.?1 10 /

/8,42 10

1,5.10 /

/3 10 зктивносп..Гг

Числитель - минимальное лолггчество, IIIIRIcl$ICNCC CIIÌCÃÈPPcêèpCI теет-аГ:ьект,1 "яы Кбеткачи 840, глюк0lllltplIHCм 20к в исследуемом корме, мкг/пробу, з знаменатель — TAT те показатель, мг:г/cl нрелуктз, Таблица 2

Влияние экстрактов из доброкачественных и токсичных комбикормов и зернопродуктов на активность глюконигрина Г20х (исходная активность 105,5 ед/ мг белка) Доброкачественное зерно и комбикорма (не токсично)

Пшеница Нет 105,4+О, 56 ячмень 105, 4+0, 4 2

Кукуруза 105, ".+О, 24

Отруби 105,3+0 60

Комбикорм . 104 9+О 64

Зернопродукты и комбикорма, зараженные микотоксинами

Пшеница Т-2 3 0 10 61 2+0 33

Ф2 2 О ° 10 74 э 9+О 51

Охратоксин А 7,5-10 66,5+0,48

-3

Афлатоксин В 8,42-10 ?1,8+0,57

Ячмень Т-2 1,9 10 67,5+0,30

Ф-2 2,0 10 71,7+0,08

Охратоксин А 3.,0 (О 52, 7+О, 11

Афлатоксин B 4, 1 10 з

74,9+0,28

5 164

Использование молекуляр)1ой модели для оценки токсичности позволяет за 3-4 ч получить окончательный результат, что позволяет считать этот метод экспрессным.

Формула изобретения

Способ опр едел ения токсич ности зернопродуктов и комбикормов,включающий экстрагирование токсинов, 0,10 (в преде0,10 лах ошиб0,38 ки опыта)

О, 19

0,57 (токсично)

42

29

37

32

36

32

1641888

Продолжение табл.2

Кукуруза

Отруби

Комбикорм+

Ф

Пробы комбикормов перед экстракцией ацетоном были просеяны по

ГОСТ 13496.8-72.

Составитель И.Тареева

Редактор Т.Лазоренко Техред М.Дидык Корректор М.Максимншинец

Тираж 373 Подписное

ВЯИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1126

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Т-2 1, 7 *10 ф-2 1,6 ° 10

Охратоксин А 3, 1 ° 10

Афлатоксин В 2,6 ° 1О

Т-2 3,6-10 з

Ф-2 4,1 ° 10

Охратоксин А 3,4 10

А@латоксин В1 3,0 10

Т-2 2, 1 10

Ф-2 1, 2 10

Охратоксин А 6,0 1.0 з

Афлатоксин В1. 2,0 10

63, 3+0, 16

56, 9+О, 20

59, 0+О, 19

84, 4+О, 38

59, 0+О, 33

69, 6 0, 63

46, 4+О, 49

70, 7+О) 39

54 9+0 71

63,3+0,60

16,9+0,12

69,7 0,48

46

44

44

34

56

33

48

84 .