Способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вируса герпеса простого типа 1 и 2.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной экспресс-диагностики герпетической инфекции, основанному па молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Целью изобретения является повышение точности дифференциациис Способ заключается в дифференциальном выявлении вирусспецифических нуклеотидных последовательностей простого герпеса типа 1 и 2 с помощью молекулярной ДНК-ДНК- гибридизации двух ДНК-зондов, каждый из которых представлен гибридной плазмидой, содержащей типоспецифический фрагмент, генома вируса простого герпеса типа 1 и 2с Чувствительность предлагаемого метода соответствует л. 1 О5 мкг вирусной ДНК о Способ позволяет проводить анализ болылого количества образцов одновременно. Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИД=ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4628160/13 (22) 05.01„89 (46) 30.04.91. Бюл. Р 16 (71) Иосковский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии (72) О.Д. Видута, И.Е. Вельтищев, А.A. Аианенко, И„А. Франк-Каменецкая, А.Ф. Ьобков и М,И. Гараев (53) 576„858(088.8) (56) Peter Е. Hiaghfield. G. Dougan.

"IIedical laboratory Sciences" 1985, 42, 352-360.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной экспресс-диагностики герпетической инфекции, основанной на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с двумя зонда ш, каждый из которых типоспецифичен„

Цель изобретения — повышение точности дифференциации.

Способ дифференциальной экспрессдиагностики герпетической инфекции основан «а молекулярной гибридизации Д!К исследуемых вирусов с ДНК„„SU„„1645302 A 1

51) С 12 (1 1/68, С 12 N 15/38

2 (54) СПОСОБ Д1Ж>ЕРЕНЦИАЛЬНОИ ИНДИКАЦИИ

ВИРУССПЕЦИФ1 ЛЕСКИ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОГ,. ТЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВИРУСА ГГРПЕСА ПРОСТОГО ТИПА 1 и 2 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной экспресс-диагностики герпетической инфекции, основанному на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Целью изобретения является повышение точности дифференциации, Способ заключается в дифс)еренциальном выявлении вирусспецифических нуклеотидных последовательностей простого герпеса типа

1 и 2 с помощью молекулярной ДНК-ДНКгибридизации двух ДНК-зондов, каждьп ф из которых представлен гибридной плазмидой, содержащей тнпоспецифический фрагмент. генома вируса простого герпеса типа 1 и 2. Чувствительность предлагаемого метода соответствует 10+ мкг вирусной ДНК. Способ позво- ляет проводить анализ большого количества образцов одновременно. зондами, представленными гибридными плазмидами рНС1021 и рНС2014, содержацими типоспецифические фрагменты геномов ВПГ 1 и 2. При этом два предложенных ДНК-зонда рНС 1021 H pHC

2014 обеспечивают дифференциальную типоспецифичную индикацию вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вирусов простого герпеса двух серотипов — индивидуально ВПГ 1 и

ВПГ 2.

Способ молекулярной ДИК-ДНК гибридизации заключается в том, что

1645302,вна дле осуществляют выбор гибридной плазмнды, содержащей типоспецифический фрагмент геномов ВПГ 1 или 2 в варианте молекулярной "спот"-гибридизации.

Использованньпr при разработке изобретения способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей герпеса 10 простого типа 1 и 2 "библиотек" EcoR 1 фрагментов ДНК ВПГ 1 и 2 получен при помощи космидного вектора рНС79. Космидный вектор рНС79 сконструирован на основе плаэмиды рВК 322 со встро- 15 енными по Рчи 1Т сайту 1,97 тыс. пар нуклеот щов Bgl II фрагментом ДНК

hach 44, несуцим cos-участок.

В качестве типоспецифичных ДНКзо щов используютт плазмиды рСН 1021 20 и рСН 2014 размером 36, 36 и 3,33 тыс. пар нуклеотидов соответственно.Плаз1 мида рСН 1021 имеет вставки F Н-EcoR

1 фрагментов ДНК ВПГ 1 размером 15,61 ,и 14,85 тыс.пар нуклеотиков,которые 25 соответствуют 0,300-0,380 и 0,8750,950 единицам физической карты.

Гибридная плаз оща рСН 1021 содержит 3 сайта EcoR 1, 3 сайта Hind III, 3 сайта Bgl II. В составе рСН 1021 30 присутствуют последовательности И,1„

H,1 Bgl II, F, Н, EcoR 1 и А, 11, С

Hind III фрагментов ДНК ВПГ 1. Эти участки генома кодируют основные поверхностные гликопротеиды ВПГ 1

gpA, gpB (участки 0,3-0,4), gpD u gpG (участки 0,87-0,95) и являются наименее консервативными в отношении перекрестной гибридизации. Выбор этой конструкции в качестве типоспецифич- 40 ного зонда обусловлен тем, что участки генона ВПГ 1 в области 0,3-0,4 и

0,85-0,95 единиц карты имеют наименьпую гомологию с ДНК ВПГ 2.

Плазнида рСН 2014 имеет вставки 45

N, О-EcoR I фрагментов ДНК ВПГ 2 размером 5,90 и 2,42 тыс. пар нуклеотидов, которые соответствуют 0,892 0,937 и 0,937-0,950 единицам физической карты генома вируса. Гибридная плазмида содеряят 3 сайта EcoR 1, 2 сайта Hind III, 3 сайта Bgl II. В составе рСН 2014 присутствуют последовательности 1, К Bgl II N 0 EcoR I

I, K Hind III фрагментов ДНК ВПГ 2.

Эти участки генбма кодируют поверхностные гликопротеиды ВПГ 2 р и р (участок 0,892-0,950) и являются наименее консервативными в отношении перекрестной гибридизации. Выбор этой конструкции в качестве типоспецифичного зонда обусловлен тем, что участок генома

ВПГ 2 в области 0,892-0,950 единиц карты имеет наименьшую дромологию с ДНК

BHl 1.

П р и н е р 1. На каждый из нитроцеллюпоэных фильтров в количестве 9 штук наносят серию пятен ДНК, ВПГ 1 (штамм Ф,) в количестве от

10 до 10 мкг ДНК в пятне, предварительно денатурированную нагреванием в течение 15 мин на кипящей водяной бане, ДНК фиксируют на фильтре в течение 2 ч при 80 С. После прегибридизации фильтра в соответствующем буфере при 65 С в течение 4-0 ч проводят гибридизацию с зондом в течение ночи при 65 С. ДНК-зонд предварительно денатурируют кипячением на водяной бане в течение 10 мин.

В качестве буфера для прегибридиэации и гибридизации используют раствор следующего состава: 5-кратный раствор Денардта (фиколл — 10, поливинилпирролидон — 10, бычий сывороточный альбумин — 10, г/л); 0,75 И

НаС1, 0,075 И цитрат На; 0,2Х додецилсульфат Na; денатурированная ДНК спермы лосося в концентрации 1Омкг/мп раствора„

В качестве зондов используют ДНК реконбинантных плазмид рСН 1021 и рСН 2014. ДНЕ рекомбинантных плазмид предварительно метят радиоактивным остром Р в составе нуклеотидного предшественника с применением метода

ДНК-трансляции. Радиоактивность P92

ДНК-зонда составляет 2 10 имп/мин. нкг. Состав буфера для ШП-трансляции: 1 мкг ДНК-зонда, по 1 мкл 1 мМ раствора каждого нз немеченых, Pдезоксннуклеотидтрифосфатов (дНТФ) и меченых Р-дНТФ с общей радиоактивностью 2-100 имп/мин, 5 мкл буфера для HIK.— трансляции (буфер 10-кратный для НИК-трансляции состава 0,5 М

Трис-НС1, рН 7,2; 0,1 И HgS04, 1 мМ дитиотрейтол и 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбуиина), 5-10 ед.активности ДНК-полимераэы 1 и Н О до обцего объема реакционной смеси 50 мкл.

Реакцию НИК трансляции проводят по известной методике. Ð-ДНК-зонда отделяют от деэоксирибонуклеотидтрифосфатов на микроколонках с сефадексом G-50 хроиатогра5302

Составитель Е„ Кузнецова

Редактор И. Касарда Техред М,Дидык Корректор М Шароши

Заказ 1322 Тиран 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

1!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комб вят "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,!01

5 164 фией с использованием центрифугирования. и

P-ДНК-плаэмиды, используемые в качестве зонда, денатурируют кипяче- нием на водяной бане при 100 С в течение 10 мин с последующим охлаждением во льду, а затеи проводят гибридизацию в течение 3-4 ч при 65 С, помецая фильтр лицевой стороной на гибридизационную смесь (буфер для гибридизации с денатурированным Р-ДНК-зондом) и наслаивая ваэелиновое масло для герметизации.

Отмывку фильтров после гибридизации осуществляют следуюцим образом„

Хлоросюрм — в течение 3-5 мин.

О,ЗИ ЛаС1, О,ОЛИ цитрат На; 0,5Х додецилсульфат Na — в течение 5 мин при комнатной температуре.

О,ЗИ NaC1, 0,0311 цитрат Иа; 0,17 додецилсульфат Иа — в течение 15 мин при комнатной температуре.

0,15И ИаС1, 0,025И цитрат Иа; 0,57 додецилсульфат На — в течение 2 ч при

65 С с однократной сменной буфера„

После отмывки фильтр высуттивают на воздухе и подвергают авторадиографированию в течение 12 ч с применением медицинской рентгеновской пленки OPWO

HSII и двух усиливающих экранов ЭУИ.

Положительными считаются пробы, даюцие четкие пятна засветки на радиоавтографе.

Оптимальным вариантом является использование ДНК-зондов рНС 1021 (Ecol(I — F, Н фрагменты), и рНС 2014 (ЕсоГ I — N, 0 фрагменты), в функциональном отношении соответствующих

10 типоспещи ичной вирусной детерминанте гликопротеидов ВПГ 1 и 2 соответственно. Чувствительность предлагаемого способа высока и способствует

10 мкг вирусной ДНК при 5 10 вирус15 ных геномов„ формула изобретения

Способ дифференциальной индикации вирусспецифических нуклеотидных последовательностей вируса герпеса прос20 того типа 1 и 2, основанный на моле кулярной гибридизации кислот с ДПКзондом, отличающийся тем, что, с целью повьвнения точности диф25 ференциации, в качестве ДНК-зонда используют рекомбинантные плазмиды рНС1021/н рНС 2014, содержащие участки генома вируса герпеса 1 и 2 типа, соответствующие вирусным детерми

30 нантам ыпикопротеидов вируса герпеса простого 1 и 2 типа.