Способ количественного определения нитратов в пищевых продуктах

 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к методам анализа токсичных нитратов в пищевых продуктах. Цель изобретения - повышение точности и воспроизводимости способа . Для этого экстракт очищают от примесных соединений на активированном угле, элюат разбавляют водой, после нитрования в реакционную смесь вводят 2-нитротолуол - внутренний стандарт при количественной оценке концентрации нитрата с помощью метода газожидкостной хроматографии. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТ2ИЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (192 (112

А1 (g1)g G 01 N 33/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4438000/13 (22) 12. 05. 88 (46) 15. 05. 91 . Бюл. № 8 (71) Институт питания AHH СССР (72) К.И. Эллер, В. В.Пименова и И.И.Аманова (53) 549.75 (088.8) (56) Дмитриев М.Т., Зарубин Г.П., Мищихин В.А. и др. Гигиена и санитария, 1985, ¹ 2, с. 51-52.

Перцовский А.Л., Марковская Т. В., Харникова Г.А. Гигиена и санитария, 1981 Р 2, с. 70. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕ-

НИЯ НИТРАТОВ В ПИЦЕВНХ ПРОДУКТАХ

Изобретение относится к пищевой промышпенности и может быть использовано для определения в пищевых продуктах токсичных нитратов, потенциальная опасность которых для здоровья человека связана с возможностью их эндогенного восстановления до нит"ритов, вызывающих метгемоглобинемию, обладающих иммунодепрессивным и тератогенным действием и являющихся предшественниками образования канцерогенных нитрозов соединений.

Цель изобретения — повышение точности и воспроизводимости.

Для этого экстракт .очищают на активированном угле, элюат разбавляют в 2,5-5 раз водой, полученной дистилляцией из шелочной среды, после нитрования в реакционную смесь вводят

2 (57) Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к методам анализа токсичных нитратов в пищевых продуктах. Цель изобретения — повышение точности и вос. роизводимости способа. Для этого экстракт очищают от примесных соединений на активированном угле, элюат разбавляют водой, после нитрования в реакционную смесь ! вводят 2-нитротолуол — внутренний стандарт при количественной оценке концентрации нитрата с помощью метода газожидкостной хроматографии.

6 табл.

2-нитротолуол (2-НТ) — внутренний стандарт при количественной оценке концентрации нитрата.

Обе эти процедуры направлены на повышение точности предлагаемого способа по сравнению с известным спосо бом. Очистка активированным углем позволяет отделить компоненты матрикса пищевого продукта, вступающие в побочные реакции нитрования с анализируемым ионом нитрата, в первую очередь белки, содержащие легко нитрозируемые ароматические аминокислоты.

Отсутствие этой стадии в методе известного способа является одним из основных факторов, снижающих действительное содержание нитрата

Разбавление водой позволяет проводить нитрование бензола на фоне в

1649426 пнг

К=- ——

"вЬ пять раз меньших .количеств веществ из продукта, не задержанных активиро . ванным углем, так как аликвота экстракта при нитровании по предлагаемому, методу соответствует 0,02 r образца вместо 0,1 г — в известном способе.

При этом относительная концентрация. основного мешающего однозначному нит- . рованию бензола аниона хлорида (по- 10 бочное образование хлористого иитрозила) снижается в 2,5 раза по сравнению с известным способом, т.е. имеется в виду не уменьшение относительной концентрации NO и С1, которые не меняются при разбавлении, а снижение абсолютной концентрации хлорида.

Существенным приемом является введение в реакционную смесь после нит, рования и перед количественным определением методом газожидкостной хроматографии (ГИХ) внутреннего стандарта, в качестве которого впервые использован 2-нитротолуол.

2-Нитротолуол наиболее близок к определяемому веществу нитробензолу по хроматографической подвижности (относительное удерживание на хроматографической колонке составляет Т

1 44) нитробензол и 2-нит- 30

НТ Г

НБ ротолуол близки по структуре и дают аналогичный по величине сигнал в детекторе электронного захвата при ГЖХ.

Способ осуществляют следующим образом. 35

Выделяют нитраты из пищевых нродуктов путем встряхивания измельченной навески пробы в дистиллированной воде. Осуществляют очистку экстракта пропусканием его через колонку, со 40 держащую смесь уголь — целит, и нитрование бензола нитратами разбавленной в 2,5-5 раэ аликвоты элюата в присутствии серной кислоты. I(реакционной смеси добавляют внутренний стандарт 2-НТ и проводят количественное определение с помощью ГЖХ с детектором электронного захвата.

В качестве основного стандартного раствора нитрата используют эталонный 50 раствор нитрата калия с концентрацией

1в10 моль/л. Для проведения ГЖХ используют эталонные растворы в гексане нитробензола (НБ} с концентрацией

0,5 мкг/мкл и 2-НТ с концентрациями

0,5 мкг/мкл (Т) и 0,05 мкгlмкл (II), а также калибровочный раствор смеси

ЯВ и 2-НТ, который предназначен для определения калибровочного коэффициента НБ по внутреннему стандарту 2НТ. Для установления точных концентраций эталонных растворов измеряют их оптическую плотность при длинах волн

330 и 257 нм соответственно. Готовят рабочий калибровочный раствор с концентрацией НБ и 2-НТ по 2 нг/мкл.

Лля определения калибровочного коэффициента (К) НБ по 2-НТ в газовый хроматограф вводят 1-2 мкл калибро- вочного раствора. Условия хроматографического анализа на газовом хроматографе с детектором электронного захвата следующие: стеклянная колонка.

2 м х 0,3 см; жидкая фаза — ЗЖ/ температура колонки 110оС; температура исо парителя 200 С," температура детектора

230 С ; скорость газа-носителя (азота) а подбирают, исходя из времени выхода растворителя (бензола) порядка 20 с, скорость газа продувки детектора 50100 мл/мин. В описанных условиях время выхода НБ составляет 2,5 - 3,5 мин, а время выхода 2-НТ вЂ” 3,7 — 5 мин.

Критерием идентификации пика НБ является совпадение его относительного приведенного времени удерживания по внутреннему стандарту 2-НТ,определяе- мому по формуле

Н Т вЂ” Т,.

НЪ где Т „„- относительное приведенное время удерживания НБ, Т нр — время выхода НБ;

Т вЂ” время выхода 2-НТ;

Tg - время выхода растворителя.

Т цля НБ на жидкбй фазе ОУ-1 оти о при температуре колонки 110 С составляет величину порядка 0,62-0,68 и опр ед ел яется э ксп еримен таль н о. Калибр овочный коэффициент К определяют по формуле где h „- высота пика внутреннего стандарта 2-НТ, мм;

h „ - высота пика НБ, мм.

Проверку калибровочного коэффициента проводят перед началом работы и после каждых пяти анализов образца.

Перед ГНХ определением в анализируемую пробу первоначально добавляют

10 мкл эталонного раствора НТ, что соответствует 0,5 мкг 2-HT Если при этом высота пика НБ в 3 и более раз

16494 26 промывают 10 мл бидистиллиронанной,. воды. Из 50 мл объединенного элюата отбирают 0,2 ил, добавляют 0,3 мл бидистиллированной воды, 3 мл перегнанного бензола, 3 мл концентрированной серной кислоты н осторожно встряхивают 10 мин, поддерживая с помощью песчаной бани температуру

10 50-60 С, по необходимости открывая

0 пробку для выравнивания давления.

После охлаждения в реакционную смесь добавляют 10 мкл эталонного раствора

2-НТ (1) что соответствует 5 мкг

2тПТ. После встряхивания и разделения слоев декантируют 1,5 мл верхнего бен.зольного слоя .в пробирку, содержащую

1 мл дистиллированной воды (для удаления остатков следов серной кислоты из бензольного слоя) .В газовый хроматограф вводят 0,2; 0,5 и 1 мкл верхне-: го бензольного раствора. »

Расчет количества нитратов, вносимых с реактивами:

h и- 12

m =05К вЂ” -m =05«14

q = 9 h ur 60

rrr

«095 = 0,11 мкг.

Расчет концентрации нитратов в 1

30 пробе: при вколе 0,2 мкл

" rr

m =05- — " — Kra нт нт

Определение ш,„проводят для каждой новой партии серной кислоты, бидистиллированной воды и бензола.

Предел обнаружения метода составляет 0,2 мг/кг лри относительном стандарт roM отклонении 0,02-0,10; степень извлечения добавленного к образцу нитрата 67-90;7.

Пример 1, К 5 r измельченной на терке пробы картофеля (предельно . допустимая концентрация (ЩК) нитратов в картофеле 80 мг/кг) добавляют

25 мл бидистиллированной воды и пере" 45 мешивают в течение 30 мин на аппарате для встряхивания . Декантированный раствор пропускают через колонку (192«15 см), содержащую 1 см смеси уголь — целит (2: 1) — нижний слой и

0,5 см целита — верхний слой, предварительно промытую 10 мл бидистиллированной воды. Для увеличения скорости тока жидкости можно использовать вакуум всдоструйного насоса (15 мм рт.ст.) . Остаток пробы промы-, вают бидистиллированной водой (Зк5 мл) и промывные воды также пропускают через колонку, которую окончательно мкг; превышает высоту пика внутреннего стандарта, то ло хроматограмие приблизительно оценивают концентрацию нитрата в пробе и затем повторяют анализ с другой аликвотой (O, 1 мл) экстракта пробы. При этом увеличивают количество внутреннего стандарта в соответствии с табл. 1.

Результаты определения нитратов представлены в табл. 1.

На хроматограмме измеряют высоты пиков НБ и 2-.НТ. Расчет концентрации нитрата проводят но формуле

С =90 (05 К вЂ” — -m -и)

h rr5.

h нт

Нт где С вЂ” концентрация нитрата в пробе, мг/кг, m < — масса внутреннего стацдарта9

Нг добавленного в пробу, мкг;, m — масса нитрата, вносимого с применяемыми реактивами, мкг.

Массу нитрата, вносимого с используемыми реактивами (m ), определяют согласно основной схеме, только вместо экстракта анализируют бидистиллированнув воду. Расчет проводят по формуле

С=50(05К вЂ” --m — ш)

h„ ц1= 50 (О 5«1 4х — --«5 — 0 11)=86 2

11

21

9 9 при вколе 0,5 мкл

29

53

С = 50 (0,5«1,4«- — -,к5 — 0,11)

= 90,5 мкгд при вколе 1 мкл

С = 50 (095 х194х-9 — «5 — 0,11)

= 86,6 мкг.

Относительное стандартное отклонение при последовательных вводах в хроматограф составило 0,03.

Пример 1а. Определение содержания нитратов в капусте по предложенному способу. ,Пять навесок. по 10 г капусты, измельченной в мясорубке, помещают в

5 конических колб на 250 мл, добавляют по 50 мл бидистиллированной (над щелочью) воды и перемешивают на аппарате для встряхивания. Декантированные растворы пропускают через 5 коло» нок (1,2«15 см), содержащих 2 см«

1649426 смеси уголь - целит (2:1) — нижние слои и О, 5 см целита — верхние слои, предварит ел ьно пр омытые

10 мл бидистнллированной воды (над щелочью), с использованием ваку5 ума водоструйного насоса. Остат- ки проб промывают бидистиллированнои водой (Зх10 мл) и промывные воды также пропускают через колонки, которые окончательно промывают 20 мл бидистиллированной воды. Из 100 мл объединенных элюатов отбирают по 0,2 мл и далее иитрование и анализ проводят согласно примеру 1. Для получения до- 15 стоверных количественных результатов в газовый хроматограф вводят произвольный объем бензольных растворов (около О, 1 мкл), контролируя лишь отклонение пера самописца, которое не должно превышать полной его шкалы.

Полученные результаты представлены в табл. 2.

m(p =

= 495,0

Количество нитрата, вносимого с реактивами m = О, 15 мкг.

Пример 2. Определение фонового содержания нитратов по предложенному методу при использовании обычной дистиллированной воды.

Определяют фоновое содержание нит- 30 ратов при использовании двух партий дистиллированной воды, осуществляя нитрование бензола согласно примеру 1, однако вместо 0,2 мл экстракта и

0,3 мл бидистиллированной воды в реакционную смесь добавляют 0,5 мл дистиллированной воды:

35, 40

0,74 мкг

Степень извлечения ИО„=

368 3-211. О

+-— -= --— - — x 100 = 52 4%

100 ф 0 °

45 Пример Зв. Определение содержания нитратов в пробах капусты без добавки и с добавкой нитратов согласно примеру 1, однако из 50 мл объединенного экстракта отбирают

0,5 мл. Расчет проводят по формуле

h мР

С * 20 (0,5 К вЂ” - m — m ), Получают:

55 . ф 48

m О 5»1 6» — — »0 5 О 17 мкг"

36

m для воды О 5к1 4» — — ФО 5 =

Ф I t 17

m для воды О 5»1 4» »0 5 =

27

0,47 мкг.

Таким образом, фоновое количество нитратов, вводимых с водой и кислотой, при использовании бидистиллированной воды (над щелочью) значительно ниже (n,11 мкг, пример 1).

Определение оптимального объема пробы (0,2 мп).

П р и и е р За ° Определяют содержание нитратов в пробе капусты (измельченной на мясорубке) согласно примеру 1. Получают: а - 0,5xi,б» х0,5 0,14 мкгд

C.1 = 50 (0,5х1,6»-- — -к40 0 14)

= 289, 3 мг /кг, " другую навеску измельченной капусты (5 г) вносят добавку нитрата в количестве 300 мг/кг (ПДК нитратов в капусте 300 мг/кг), что соответст- . вует 15 мкл рабочего стандартного раствора нитрата или 1,5 мг нитрата в пересчете на NO>. Экстракцию и очистку экстракта проводят согласно примеру 1. Получают:

0 14 мкг, 50 (О 5»1 Ỡ— — -x40 — О 14) =

32

102

1 мг/кг.

Степень извлечения NO> составила

Се-С 495 0-289 3 — — ---»100% = — — — — -<-— --- x 100 =

300 " 300

= 68,6%.

Пример Зб. Определяют содержание нитратов в пробах капусты беэ добавки и с добавкой нитратов согласно примеру 1, однако из 50 мл объединенного экстракта для анализа отбирают 0,3 мл. Расчет проводят по следующей формуле:

С =333 (05K — — -m — ш)

1 к6

У ° н

НY

33,3 (Оь5»1,6»-63-»10 — О, 14)

51

211,0 мг/кг (концентрация нитратов пробе без добавки нитратов);

10. ш = О 5»1 бх — --кО 5 = О 14 мкг

29

У

С = 33,3 (0,5»1,6» — --«40 — 0,14) =

33

368,3 мг/кг..С 20 (О 5к1 бк — — -»40 — О 17)

43

155 в

174, 1 мг/кг (концентрация нитратов

1649426

10 где М

Y

P

А количество нитрат-ионов по калибровочному графику, нгI объем бензольного экстракта, МЛ; объем водного экстракта, мл объем вводимой в испаритель хр ома тографа пробы, мкл; навеска продукта, г; объем аликвоты водного экстра кта, мл; 55 концентрация нитратов, обуславлинаемая фоновым содержа-, нием в реактивах, мг/кг. в пробе без добавки нитратов);

С = 20 (О 5х1 6x- — --л40 — 0 t7)

57

К 115

Ф

= 297,1 мг/кг (концентрация нитратов 5 в пробе с добавкой нитратов) .

Степень извлечения NO

297 1-174 1 т <100 = 417..

Из примеров 3а, б, в следует, что разбавление пробы при нитровании в

2,5 раза снижает потери нитратов в анализе.

Пример 4. Определение содержания в пищевых продуктах по известному способу.

К 10 г измельченной пробы картофеля добавляют 100 мп дистиллированной воды и переменивают в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Раствор фильтруют через вату. Отбирают 1 мл фильтрата, добавляют 3 мп бензола, 3 мл концентрированной серной кислоты и осторожно встряхивают 10 мин, периодически открывая пробирку для выравнивания давления. После расслоения органический слой декантируют и в испаритель хроматографа последовательно трижды вводят t мкл бензольного раствора. Для расчета концентрации используют метод абсолютной калибровки, который предусматривает получение калибровочной характеристики по стандартному раствору НБ. Определение содержания нитратов по известному способу представлено в табл. 3.

Относительное стандартное отклонение при получении точек калибровочной кривой составило 0,19 — 0,25.

Расчет концентрации нитратов в пробе картофеля (пример 4) проводят по формуле

PyPx Y

SrP>A

С

Для определения фоновой концентрации нитратов (С ) проводят анализ, заменяя экстракт продукта дистиллированной водой.

Получают .

С вЂ” ь — 8,4 мг/кг,"

1а4кЗ ê100

5 10х 1

6 6юЗ «100

С = -- — — — -- — 8,4 = 31 2+

5 х10>1

+5, 7 мг/кг.

Относительное стандартное отклонение при последовательных вводах проб в хроматограф составило О, 18 (в сравнении с 0,03 в примере 1).

В другую навеску измельченного: картофеля (10 г) вносят добавку нитрата в количестве 80 мг/кг (ПДК нитратов в картофеле 80 мг/кг), что соответствует 4 мкл рабочего стандартного раствора нитрата с концентрацией

1110 з моль/л или 0,8 мг NO . Экстракцию и очистку экстракта проводят согласно примеру 4. Получают:

С, = 8,4 мг/кг, 4 6ХЗ 100

2 2 10 1

8,4 = 60,6 мг/кг, Степень извлечения NO З составила

Се-С< 60 6-31 2 — --"-х100% = +-— ----- -"- s100 =

80 80

= 36,8Х (в сравнении с предлагаемым способом 68,6Z, пример За) .

Пример 4а. Определение содержания нитратов в капусте по известному способу, Экстракцию и анализ повторяют пять раз с навесками по 10 r измельченной капусты из примера 1а согласно примеру 4. В испаритель хроматографа вводят по 1 мкл исследуемых растворов.

Результаты представлены в табл. 4, Таким образом, применяемые приемы: очистка экстракта на активированном угле, его разбавление и проведение реакции нитрования в стандартизированных температурных условиях — приводят к повьппению точности и воспроизводимости результатов (относительI ное стандартное отклонение 0,074 в сравнении с 0,30 в известном способе) .

Опыты, подтверждаюцие повьппение воспроизводимости предлагаемого метода при использовании внутреннего стандарта: а) в хроматограф вводят по

1649426

1 Икл стандартного раствора, содержащего 0,15 нг нитробензола.

Полученные результаты представлены в табл. 5.

5 б) в хроматограф вводят 0,1-0,3 мкл. смеси НБ:НТ в массовом соотношении

1, 5: 1, 7. Расчет количества НБ в смеси проводят на основе калибровочного коэффициента НБ по НТ. 10

Полученные результаты представлены в табл. 6.

Способ количественного определения нитратов в пищевых продуктах, вклю- . чающий экстракцию нитратов из образца водой, нитрование бензола в присутствии серной кислоты с последующим 20 определением нитробензола методом газожидкостной хроматографии с детектором электронного захвата, о т л и—

Таблица

Концентрация эталонного раствора внутреннего стандарта, мг/мл

Ориентир овочная конОбъем добавляемого раствора внутреннего стандарта, мкл

Масса добавленного центрация нитрата в пробе,мг/кг внутреннего стандарта 2-НТ,, мкг

0,05 (II)

О,s (х)

0 5 (I)

О,s (х) 20 -40

40 — 100

100 — 200

Более 200

10

10

Таблица 2

Калибр. Кол-ва ИОу, коэйфи- вносимые в циент реактив., мкг

Высота Высота Содерж. пика НБ, пика НТ, 80>, мм мм мг/кг

1,4

2 1,4

0,15

102,0

92,5

102,6 7,6 0,074

0,15

1,4

0,15

118

105, 5

1009 0

113,4

1,4

148

0,15

1,4

0,15

103

Формула изобрет ения ч а ющи и с я тем, что, с целью повышения точности и воспроизводимости, экстракт очищают на активированном угле, полученный элюат разбавляют в 2,5-5 раз дистиллированной водой, полученной дистилляцией из щелочной среды, в .реакционную смесь после нитрования вводят 2-нитротолуол, а определение проводят по Формуле

С = 50 (О,g К (h<

К вЂ” калибровочный коэффициент,"

h „- высота пика нитробензола, мм;

h - высота пика внутреннего станцт дарта 2-нитротолуола, мм, ш „- масса внутреннего стандарта, добавленного в пробу, мкг;

m - масса нитратов, вносимых в пробу с применяемыми реактивами, мкг.

1649426

Таблица 3

От н осительное стаиВысота пика нитробензола, Kth мм (при трехкратной повторности опыта) дартное отклонение

Содержание NO Х мг/кг

5,2 145

100

* В скобках указано количество образующегося нитробензола.

Таблица 4

Опыт Кол-во»О» по калибров. графику, нг

Фоновая концентSr рация NO>, мг/кг

130 6 39,2 0,30

1хЗх100

-L-- — — — т 11

Зх10х1

3,7

t84

139

5,0

3,2

Таблица 5

Высота пика г

НВ, ед. йнтегратора

Sr

Ввод Введено, нг

4008,7 1042,7 0,26

1 0,15

2 0,15

4t36

3899

3940

3 о,t5

4 0,15

3688

5 О, 15

6 0,15

5201

4332

4355

3620

3108

Количество NO, I ;нг, взятого на ! нитр овани е б ен з ола по способупрототипу*

1 (2)

2 (4)

3 (6) (8)

5 (10)

6 (12) 7 0,15

8 0,15

О,15

10 О ° 15

10,2+2,5

15, О+3,4

22, 7+4, 7

28,6+5,5

37, t+7 ° 0

42,5+8,7 -:

0,25

0,23

0,21

0,19

0 19

0,21

l6

1649426

Таблица 6

Высота пика. Отношение

НТ, ед, ин- высот тегратора

Высота пика

НБь ед.интегратора

Введено, мкл

Ввод

Оь638 Oi015 Оь024

8241

5233

7061

4519

3362

2070

4137

2556

4457

6873

6297

4128

4529

2913

3484

7 0,2

8 0,2

5345

С6ставитель С.Пылова

Редактор T.Jla зоренко Техред М.Моргентал

Корректор Т.Палий

; Заказ 1518 Тираж 418 Подписное

ВНИИПИ

ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент" r Ужгород . Г

"i . Ород, ул. агаринаь101

1 0,3

2 0,3

3 0,1

4 0,1

5 0,3

6 0,3

0,635

0,640

0,615

0,618

О, 648

0,656

Оь643

0,652