Способ обнаружения неклассического вируса

 

Изобретение относится к вирусологии и полет быть использовано для обнаружения некляссических вирусов з анализируемых образцах. Целью изобретения явпяется повышение точности. 71лч того отбирают пробу вируссодер- .кап ого материала, освобождают ее от классических вирусов, вносят в культуру ГГ-1.НИ астроцитов морской свинки, и RuTopvw вносят конканавалин А в концентрации 20-25 мкг и Н-тимидин, и оценивают уровень включения Н-тнмил,ича в клеточную ДНК и при отсутствии пролифе-рации судят о наличии вируса. 1 таил. с $ (Л

СОЮЗ СОВГ1 СНИХ

СОЦИАЛИСтИЧ УСНИ)(РЕСПУБ) 1ИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А BTOPGKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВЪ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4666839/13 (22) 27.03.89 (46) 07.06.91. Бюл. v- . 1 (71) Белорусский научно-ис.".ледовательский институт эпидемиологии и 1111кробиоло гии (72) Н.Н.Полещук, З.Б.Кпачена, Г.M.Èãíàòüåâ и П.Г.Рытик (53) 576.8.094..)с)(038.8) (56) Баринский И. Ъ., Рубла:(зе А.1 .

Этиология хронических вирусных,)ейроинфекций. — М.: Медиц)111я, 1 ::Р4 с . 166.

Коломиец H..!1. и цт, Кли;1ико-;,ip1)ологическая хара. .терн . тика и лаб)раторная диагностика лейкоспонгиоза, Минск, 1986.

Изобретение относится к вирусологии и может быть и<11«1ëüзоRàHо д.!ÿ обнаружения неклассичес них вирусов н анализируемых образцах.

Целью изобретения яв)-яется цс 1ышение точности.

Дня этого нируссодержящий материал освобождают от класс11ческих нозбудителей инфекционных зяболевян11й обработкой при 1()0 С в течение 15 мин, вводят н культуру астроцитов морских свинок и сразу же н нее вносят Кон-А (в дозе 20-25 мкг/мл), через - дня дополнительно вводят Н вЂ” тимидин, на 3 сут о наличии нозб1удитсля судят по потере астроцита.m способности отвечать пролиферациеи ня м.1тоген.

Сущность способа заключается в следующей последонат явности опера)ц1й. (gg)5 С - 1 /)00, А 61 IC 39/1?,G 01 !(33/48 (54) „-110СОБ ОБНАГБКЕШИ НЕКЛАССИЧЕСКОГО БИ1 УСА (57) Изобретение относится к вирусологи11 и 11ожет быть использовано для обнаружения неклассических вирусов н анялиэируемых образцах. Целью изобретения является повышение точности .

1лэ ..того отбирают пробу нцруссодер:кя1пнг, мятериал"., оснобождак1т ее от

,чассических вирусов, в .1< сят в культуру тк.. ни астроцитон морской свинки, и к,)то1 у1) вносHT конкананалин А в

Э кснцентрации 20-?5 мкг и Н-тимидин з оцс ни «яют урон е1 нключе ния Н-тимицина н кчеточную ДНК и при отсутствии пролцфс рации судят о наличии вируса.

1 табл .

П11«дцарительные этапы. Прежде, чем цс с .едонять инфекционный матсриал, зярян.с готовят ростовые среды, культуру астроцитон и определяют оптимальную к; нцентрацию митогена (Кон-А).

Hp.1ãîòîâëåHèå культур астроцитон.

Источником получения культур служат нонорожде.1ные морские снинки. Под эфирным наркозом вскрывают черепную ко1обку, извлекают большие полушария голов:1ого мозга и немедленно помещают во флаконы со стандартным раствором

Хенкса, содержащим пенициллин (i.Ì) ед/мл) и гентамицин (.5 мкг мл) .

Удачяют пинцетом мягкую мозговую оболочку и крупные сгустки крови. Ножницами с узкими браншами разрезают больп)ие полушария на две части, из области височной части коры вырезают кусо1654 333 чек ткани объемом 10-15 мм и переносят его в чашку Петри с ростовой сре" дой (сыворотка плодов коров 30, 5%-ный гемогидролиэат 70 с добавлением 0,2 М раствора L-глутамина иэ

5 расчета 1 мл на 100 мл среды и гентамицина ?5 мкг/мл), где измельчают до кусочков объемом 0,5-1 мм . После этого, совместно с ростовой средой собирают кусочки пастеровской пипеткой и пропускают через нейлоновое сито первоначально с размером пор

150 мкм, а затем 75 мкм.

Получают пеРвичный моноалой, состоящий на 85-.90% из астроцитов. Для этого приготовленную клеточную взвесь (10 мл) переносят в культуральные флаконы с площадью дна 22 см, помещают в термостат и инкубируют при

37 С с 5% содержанием С0< в течение

1 недели.

После образования сплошного монослоя культуральную среду удаляют, вносят 2,5 мл смеси (+31 С), состоящей из 0, 1Х трипсина и 0,02% версена в соотношении 1:5, выкидают 1-2 мин (контроль под микроскопом, до набухания клеток). Сливают смесь и пастеровской пипеткой вносят ростовую сре- 30 ду в объеме 5 мл, пипетируя струей ,пля снятия клеточного пласта (5-10 манипуляций). Используя камеру Горяева, подсчитывают количество клеток в 1 мл, при необходимости доводят их концентра Ростовой средой до 1.104 „„ /мл 35

Клеточную взвесь можно сразу переносить для культивирования в лунки пластиковой панели и использовать для обнаружения вируса или хранить в жид- 40 ком азоте, восстанавливая по мере необходимости.

Хранение культур астроцитов.

Клетки переносят пипеткой в пробирки, центрифугируют 10 мин при

1500 об/мин, надосадок удаляют, а оставшиеся клетки разводят криозащитной средой (5X гемогидролиэат, РН

7,2-7,4 10X, сыворотка плодов коров ,20%, глицерин 10X) до концентрации

2 108 кл /мл

Приготовленную суспенэию астроцитов разливают по 3 мл в стерильные ампулы и герметично закрывают. Ампулы с астроцитами поэтапно охлаждают выдерживанием при +4 С 2 ч, затем помещают в ванночку с 96 .-ным этилоо вым спиртом, охлажденным до -10 С, Используя жидкий азот, замораживают клетки, соблюдая следующий режим, град мин ст -10 до -? ) 1 ° от 20 ,о

1 до -40 1,5 от -40 до — 70 3. После чего погружают в сосуд с жидким азотом и хранят лри -196 С.

Жизнеспособность клеток сохраняется более двух лет.

Восстановление культур астроцитов после хранения в жидком азоте и подготовка их для вирусологических исследований .

Ампулы с суспенэией астроцитов извлекают из азота и немедленно помещают в водяную баню на 1-2 мин при

+31 С. Затем вскрывают, содержимое

- о переносят в культуральные флаконы объемом 5 ) мл и помещают в С0 инкуО

2 батор при +3 С. Через 24 ч меняют ростовую среду на RPMI-164 ) с 1;) сывороткой плодов коров и культивируют в течение 5-6 дней до образования сплошного манослоя. Ионослой снимают раствором трипсина и версена, как описано выше. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в полученной суспензии, затем разводят росте.-ой средой ПР)П-1640 до концентрации 7 ° 1 ) кл ., мл. Приготовленную кул. туру астроцитов в суспензии, внося в ячейки 96-луночных пластиковых панелей, используют для обнаружения возбудителя.

Приготовление сред для культивирования астроцитов. Для приготовления первичной монослойной культуры астроцитов используют ростовую среду на основе 5% гемогидролизата.

Для постановки опыта в пластиковых панелях применяют среду RPMI-164 ).

В среду добавляют следующие необходимые ингредиенты. 1-глутамин 2мИ, антибиотики 1 )0 мкг/мл хлоркальциевого комплекса стрептомицина и

10 ) ед./мл пенициллина, 10% сыворотки плодов коров, инактивированной при

56 С в течение 30 мин. Для стабилизации РН среды (1,4) добавляют раствор

HEPES (N-2-гидроксиэтилпипераэин-N-2этансульфановая кислота) в окончательной концентрации 10 мИ.

11риготовление раствора митогена.

В качестве митогена используют Конканавалин А (Concanavalin А, Serva) .

Готовят матричный концентрированный раствор на среде КР)П-1640, содержащий Кон-А, в дозе 100 мкг/мп, который разбавляют перед использованием до нужной концентрации. Исходя иэ того

33 6

4Р

5 16543 что и лунки пластиковой панели приготовленную суспенэию астроцитов и раствор митогена добавляют в равных количествах (т.е. происходит раэбан5 ление митогена в два раза), растворы митогенов готовят в концентрациях, в дна раза превышающих необходимую (20, ЗО, 40 мкг/мл и т.д.) .

Определение оптимальной концент- 1ð рации мнтогена Кон-А для стимуляции пролифератинной активности астроцитов.

Определение доэоэависимого стимулирующего эффекта митогена осуществляют внесением Кон-А в конечных концентрациях 1О,20,25,40 и 50 мкг/мл в незараженные культуры астроцитов морских свинок, находящихся в лунках пластиковых панелей (100;)() кл./мл ростовой среды). для этого в каждую из 2р

15 лунок с астроцитами н первом варианте опыта вносят Кон-А в О, 1 мл ростовой среды RPt(I-164:) (концентрация 1() мкг/мл).

Ro втором варианте опыта в 15 лу- 25 нок с культурой астроцитов вносят

Кон †в О, 1 мл ростовой среды RP Ï—

1640 (концентрация 20 мкг/мл).

В третьем варианте опыта н каждую из 15 лунок с астроцитами вносят Кон-А 3р в 0,1 мл ростовой среды КР;П-164,) (концентрация 25 мкг/мл и т.д.) .

Контролем служат 15 лунок с культивируемыми астроцитами без митогена.

Пластиковые панели помещают в термостат и культивируют при +31 С с 57 содержанием СА>.

На вторые сутки культивирования в каждую лунку опыта и контроля вносят

5 мкКм Н-тимидина в (),05 мл среды э

КР)П-164 ).

На третьи сутки из лунок пипеткой удаляют культуральную среду и добанляют ),2 мл физраствора, клетки суспензируют и переносят на цел-.,олоэные 45 фильтры с диаметром пор (),85 мкм °

Затем их последовательно обрабатывают

57.-ным раствором трихлоруксусной кислоты, 96Х-ным этиловым спиртом и переносят во флаконы с 6 мл толуолового 5р сцинтиллятора. Пролифератинную активность астроцитов определяют на жидкостном сцинтилляционном спектрометре, учитывая уровень синтеза клеточной

ДНК по включению н нее Н-тимидина. 55

Установлено, что индекс стимуляции пролиферации (отношение количества импульсов в 1 мин н культурах астроцитов с Кон-А к количеству импульсов в 1 ьин в культурах без Кон-А) наиболее высокий при внесении Кон-А в концентрации 20-25 мкг/кл. (алые концентрации Кон-А (10 мкг/мл) на третьи сутки вызывают более низкую стимуляцию пролиферативной активности, а более высокая концентрация (50 мкг/мл) вообще не вызывает пролиферации клеток.

Таким образом, наиболее оптимальной концентрацией митогена Кон-А для стимуляции пролиферативной активности астроцитов морских свинок является доза 20-25 мкгlмл.

Влияние различных концентраций

Кон-А на пролифератинную активность астроцитов морской свинки показано и таблице.

Инфекционный материал (нервная ткань людей, животных, культура клеток и т.п.) гомогенизируют, добавляют физраствор, центрифугируют при

6000 об/мин 15 мин и удаляют осадок.

Надосадок обрабатывают в водяной бане при 100 С в течение 15 мин.

В 45 плоскодонных лунок пластиковой панели вносят взвесь астроцитон в объеме 0,1 ип ростовой среды, содержащей / ° 1 ) клеток и инкубируют . Ь в термостатах при +3/ С с 5Х содержанием CQ .

Через 2 ч в первые 15 лунок вносят по 0,05 мл обработанного вируссодержащего материала и сразу же в них добавляют по 0,1 мл Кон-А в дозе

20-25 мкг/мл . Во вторые 15 лунок (контроль митогена) вносят ло ),05 мл среды культивирования и О, 1 мл Кон-А в дозе 20-25 мкг/мл. В оставшиеся

15 лунок (контроль опыта) вносят только по 0,05 мл среды культивирования беэ митогена.

Культуры помещают в термостат и инкубируют при +37 С с 57. содержанием СО .

На вторые сутки в каждую лунку опыта и контроля вносят 5 мкКи Н"гимидина в 0,()5 мл среды культивирования.

Обнаружение возбудителя проводят на третьи сутки, используя жидкостный сцинтилляционный снектрометр, определяют пролифератинную активность астроцитов по включению Н-тимидина в клеточную ДНК, учитывают количество импульсов в 1 мин в опытных и контрольных культурах. Присутствие возбудителя устанавливают по потере инфицированными астроцитами способ1654333 ности отвечать пролиферацией на дей- ствие митогена.

Пример 1. Обнаружение возбудителя амиотрофического лейкоспонгио5 эа (АЛ) в ткани ЦНС больного Д.

Иэ мозга (кора больших полушарий) через 3 ч после смерти выделяют кусочек ткани (0,3 r), помещают в ступку, гомогениэируют, добавляют 2,7 мл физ- 10 раствора, переносят суспензию в пробирку и центрифугируют при 6 )00 об/мин в течение 15 мин. Собирают надосадок и прогревают при 100 С 15 мин в водяной бане. 15

В первые 15 лунок пластиковой панели, содержащей культуру астроцитов, вносят 0,05 мл обработанного, как указано выше, надосадка суспенэии мозга больного Д. и сразу хе в эти лунки 2р добавляют О, 1 мп Кон-А (в дозе

25 мкг!мл).

Во вторые 15 лунок пластиковой панели с культурой астроцитов вносят

0,05 мп среды RPMI-1640 и добавляют

О, 1 мл Кон-А (в дозе 25 мкг/мл).

В контрольные 15 лунок пластиковой панели с культурой астроцитов вносят только 0,05 мп среды RPMI-164:) без митогена. Зр

Пластиковые панели помещают в термостат и инкубируют при +37 С с 57 содержанием СО<.

На вторые сутки во все лунки с астроцитами в опьгге и контРоле вносят

5 мкк Зндина в,), )5, среды- 35

RPNI-1 64 0.

На третьи сутки пипеткой удаляют культуральную жидкость, добавляют в каждую лунку 0,2 мл физраствора, клет-1р ки суспенэируют и переносят на целлюлоэные фильтры с диаметром пор

0,85 мкм. Обрабатывают фильтры 57.-ным раствором треххлоруксусной кислоты, промывают 96Х-ным этиловым спиртом, 45 высушивают и помещают во флаконы с толуоловьвю сцинтиллятором. Пролиферативную активность оценивают по включению Н-тимидина в клеточную ДНК.

Уровень включения Н-тимидина в пер50 вых (опытных) 15 лунках с внесенным вируссодержащим материалом и митогеном - 5380+240 импlмин, во вторых (контроль митогена) 15 лунках, содержащих астроциты и митоген без вируса, 13088 982 имп/мин и в последних (контроль опыта) 15 лунках, содержащих только культивируемые клетки, 5260 ,+590 имп/мин. Разница между средним числом импульсов с учетом средней ошибки в опыте (первые 15 лунок) и контроле опыта статистически незначима, а разница между средним числом импульсов в стимулированных митогеном астроцнтах (контроль митогена — вторые 15 лунок) и контролем опьгга статистически значима, т.е ° зараженные астроциты не отвечают пролиферацией на внесенный митоген.

Таким образом в ткани ЦНС больного Д. содержится возбудитель АЛ. Посмертная верификация заболевания амиотрофической лейкоспонгиоз.

Пример 2. Обнаружение возбудителя АЛ в ткани ЦНС больного Л.

Проведено взятие ткани объемом

0,5 см из области центральной извилины коры больших полушарий головного мозга. Обработку вируссодержащего материала, последующее заражение клеток, внесение митогена Кон-А, (концентрация 20 мкг/мл) и подсчет пролиферативной активности проводят, как описано в примере 1. В зараженных культурах стимулирующего действия

Кон-А на астроциты не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточЭ ную ДНК, имп/мин: 6150+955 (опыт);

12850+354 (контроль митогена);

589<9340 (контроль опыта) .

Таким образом; внесение суспензии ткани мозга больного Л. в культуру привело к потере астроцитами способности отвечать пролиферацией на митоген. В ЦНС больного Л. находится воз-! будитель АЛ. !

Пример 3. Определение возбудителя АЛ в ткани ЦНС морской свинки экспериментально воспроизведенным заболеванием.

Морской свинке инокулируют интрацеребрально О, 1 мл 107-ной суспензии мозга больного Д., умершего от АЛ.

Через 1,5 мес после заражения у него появляются клинические признаки заболевания, проявляющиеся в выпадении шерсти, атрофии мышц, развитии парезов и параличей конечностей и туловища. В терминальной стадии заболевания у животного под эфирным наркозом берут мозг для вирусологических исследований. Обработку и внесение вируссодержащего материала в культуру астроцитов морской свинки проводят как описано в примере 1. Через 3 дня определяют пролиферативную активность астроцитов по уровню включения Н-тиэ

1Г>54333!

15 мидина в ДНК. В зараженных культурах стимулирующего действия митогена на астроциты не отмечено . Урове нь включения Н-тимидина в клеточную ДНК, 3 имп/мин: 4980+350 (опыт), 1 ")50+900 (контроль митогена); 5420+570 (контроль опыта) .

Таким образом, в ткани ЦНС исследованной морской свинки находится возбудитель АЛ.

Пример 4 . Определение персистенции возбудителя АЛ в ионослойных культурах клеток, полученных из мозга больного Д., умершего от АЛ.

Сливают культуральную жидкость, механически отделяют клетки (около

1000 клеток), добавляют 5 ил физраствора и переносят в пробирку.

Дают клеткам 15-20 иин отстояться, 20 сливают физраствор, 3-кратно замораживают и размораживают, гомогенизируют и обрабатывают, как описано в примере 1. После этого вируссодержащий материал вносят в культуру астроцитов 25 морской свинки. Через 3 дня исследуют уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК. В зараженных культурах стимулирующего действия Кон-А в дозе

25 мкгlмл на астроциты не отмечено. 3О

Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК составляют, имп/мин: 4 778+.

+294 (опыт); 14001 -20 ) (контроль митогена); 496:)+3!0 имп/мин (контроль опьгта).

Таким образом, в монослойной культуре клеток, полученной от больного Д., персистирует возбудитель АП.

Пример 5. Определение влияния очищенных препаратов возбудителя АЛ 40 на астроциты.

Культуральную жидкость, полученную из монослойной культуры мозга больного Д., (титр возбудителя АЛ в культуральной жидкости 5, 1 18 ИЦ 50/мл), 45 обрабатывают как в примере 1, затем концентрируют 8 раз сухим полиэтиленгликолем и вносят по 0,1 мл в лунки пластиковой панели с культурой астроцитов, учитывают так, как описано ранее. В зараженных клетках стимуляции пролиферации Кон-А в дозе 25 мкг/ип не отмечено. Уровень включения Н-тимидина в клеточную ДНК, имп/мин:

6200<356 (опыт); 1324 1+450 (контроль митогена); 5/80iq75 (контроль опыта) .

Таким образом, внесение очищенных препаратов возбудителя АЛ в культуру привело к потере астроцитами способности отвечать пролиферацией на митоген.

Пример 6. Больной П. Патологоанатомический диагноз — болезнь Иильдера.

Вирусологическое исследование ткани ЦНС проводят, как описано в примере !.

Как в первых 15 лунках с внесенной мозговой суспензией больного ПВ, так и во вторых 15 лунках, не содержащих какого-либо дополнительного материала под действием Кон-А в дозе 25 икг/ил, отмечается увеличение пролиферативной активности астроцитов. Уровень включения 3 H-тииидина в клеточную ДНК, импlмин: 12384+405 (опыт)) 13233+370 (контроль митогена); 5100+З10 (контроль опыта).

Таким образом в ЦНС больного ПВ возбудитель АЛ отсутствует.

Пример 7. Больной П. Патологоанатомический диагноз — амиотрофический боковой склероз.

Вирусологическое исследование ткани проводят, как описано в примере 1.

Как в первых 15 лунках с внесенной мозговой суспензией, так и во вторых

15 лунках, не содержащих какого-либо дополнительного материала под дейстзием Кон-A в дозе 25 мкг/ия, отмечено увеличение пролиферативной активности астроцитов. Уровень включения

Н-тииидина в клеточную ДНК имп/мин:

12820+290 (опыт); 13115+570 (контроль митогена); 5490+520 (контроль опьгта).

Таким образом в ЦНС больного J1. неклассический вирус АЛ отсутствует.

Формула изобретения

Способ обнаружения неклассического вируса, включающий отбор пробы вируссодержащего материала, освобождение его от классических вирусов, внесение его в культуру клеток с последующей оценкой наличия вируса, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в качестве культуры используют астроцпты морской свинки, в которую вносят конконавалин А в концентрации 20 — 25 мкг/мл и Н-тимидин, а оценку проводят по включению Н-тимидина в клеточную

ДНК и при отсутствии пролиЛерлцин судят о наличии вируса.!

1654333

Характеристика культур

25 40

j 50

780 702

5284 31 )

2,5

t=7,58

P(), 0 )1

0,9

t-=-0, 79

Р)0, )5

1,5

t=8,45

P«), ili)1

7.,0

t5,5

Р< ),001

1,5

t-=3, 29

Р(0, )1

Редактор Н.Гунько

Заказ 1930 Тиразк 394 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Рау)эская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент" ° г.уигород, ул. Гагарина, 101

Астроциты, обработанные Кон-А, импlмин

Астроциты беэ

Кон-А, имп/мин

Индекс стимуляции пролиферации

Зависимость уровня включения Н-тимидина в ДНК клеток

3 от дозы вносимого материала (митогена) в количестве, мгк/мл

10440 880 1 3088+982 805 )[phone]

Составитель И.Тареева

Техред Л.Олийнык Корректор М.Самборская