Штамм f-вируса картофеля для получения антигена, используемого при производстве диагностической сыворотки

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСП БЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ASmPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHpbfTHRM

flPH ГКНТ СССР (21) 4696835/13 1 (22) 18.04 ° 89 (46) 07. 04. 91. Бюл. N - 13 (71 ) Научно-ис следов атель ский институт картофельного хозяйства, научнопроизводственное объединение по картофелеводству Госагропрома РСФСР и

Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микро- биоло гии (72) К. Ф. Герасимова, Т..В. Тенсина, Н.А.Погорилько и В.А.Шмыгля (53) 576. 8(088. 8) (56) Попкова К.В,, Шнейдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля. — М.: Колос, 1 980 „1 93-1 94.

Изобретение относится к фитовиру- . сологии, в частности к иммунодиагностике и касается нового штамма Г-вируса картофеля.

Целью изобретения является получение нового более активного F-вируса картофеля (аукуба-мозаики).

Штамм 7-вируса (аукуба-мозаики) картофеля выделен из естественно зараженных растений картофеля сорта

Эпикур Ему присвоен HQMep F< °

Штамм депонирован в коллекции штаммов вирусов растений Всесоюзного

НИИ защиты растений под номером 18.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические и физические свойства. Штамм Р -вируса аукуба-мозаики

„„Я0„„164О16О А1

:, (51)5 С 12 N 7/00, А 01 N 63/00, G 01 N 33/53

2 (54) ШТАММ F-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ ДЛЯ ПО=

ЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ПРИ

ПРОИЗВОДСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ (57) Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике, и касается нового штамма

F-вируса картофеля. Целью изобретения является получение нового более активйого штамма F-вируса картофеля, Штамм выделен из естественно зараженных растений картофеля. Ему присвоен

h F<. Он депонирован в коллекции

ВИЗР под Р 18. Титр штамма в рабочем разведении при калельной агглютинации составляет 1:32, а у известных — 1:8, 1; 1 6. Выход чисто ro пре пара та вируса из р а с те ний дурман а со с тав ляе т . 24,4 мг на 1 кг листьев. 2 табл. картофеля имеет нитевидные частицы размером 580х11 нм. Точка температурной инактивации 59+1 С, точка предельного разведения сока 10 . Инфек-б ционные свойства в соке растений махорки при 4 С сохраняются 24 дня, а при 18,5 С вЂ” 14 дней.

Коэффициент седиментации равен

180 S мол.масса белка вируса

28500D, Круг восприимчивых растений. Штамм

Fa в растениях картофеля находится в 1 основном в латентном состоянии. На листьях махорки — Nicotiana rustica и дурмана Datura stramonium, выросших сразу за инокулированными, вызывает симптомы в виде побелевших ко3

1640160 лец или полуколец, окружающих зеле.„ную ткань, которые сохраняются 2-3 недели после появления. Эти два вида

-растений используют в качестве растений-нако пителей Р-вируса. На растениях Nicotiana glutinosa ой.вызывает желтую мозаику, а на растениях перца

Capsicum annuum - светло-коричневые локальные некрозы с последующим опаданием листьев, некрозом верхушки и стебля. Этот вид растения используют в качестве растения-индикатора. На растениях гомфрены - Gomphrena globosa и гибрида А-6 (Solanum demissum х Бо1аппш tubегоsum сорт Аквила) он вызывает некрозы в виде небольших темных пятен.

Культивирование, Штамм F легко передается механическим. путем с помощью корборунда на растения махорки

Nicotiana rustica и дурмана Datura

stramonium, которые используют для накопления вирусного антигена.

Характеристика антигена. Штамм F< в растениях махорки Nicotiana rustica накапливается в высокой концентрации, титр сока с одной и той же сывороткой в рабочем разведении при капельной агглютинации равен 1:32, что в 24 раза вьппе по сравнению с известными штаммами, титр сока у которых равен (1 8) — (1:16) .

Штамм Р6 характеризуется высоким выходом чистого препарата вируса из растений дурмана, который составил

24,4 мг на 1 кг листьев, что в 3б раз больше по сравнению с другими штаммами (табл. 1).

Штамм F@ обладает высокой антигенной активностью. Титры приготовленных для производственных целей пяти сывороток к этому штамму равны (1:2048) - (1:8192), что в 4-8 раз выше титров сывороток, приготовленных к производственному штамму.

Условия хранения штамма. Штамм F< в лаборатории поддерживают в растениях картофеля, которые выращивают в изолированных условиях. В летний период клубни картофеля со штаммом Pg высаживают на опытном участке под изоляторами или в пленочно-марлевом домике. В зимнее время клубни хранят в хранилище. Штамм Fg сохраняет антигенную активность в очищенных и затем лиофилиэированных препаратах (очищенных вирусных антигенах) в течение года. Штамм F поддерживают в пробирочной культуре Nicotiana glutiпоза. Пробирочные растения периодически (через 2 мес) черенкуют и пересаживают на свежую питательную среду.

Сравнительное изучение штамма.

Сравнительное изучение патогенности и анти генной актив ности штамма F< проводили в НПО по картофелеводству

Госагропрома Нечерноземной зоны РСФСР и Украинском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии в 1980-1986 годах.

Патогенность штамма Fg по сравнению с другими штаммами F вируса изу-. чали на растениях картофеля Solanum

tubегоsum и перца Capsicum annum

На основании полученных данных изучаемые штаммы были разделены на сильнот, средне- и слабопато генные.

F< отнесен к группе слабопатогенных штаммов. На растениях картофеля на второй год после заражения он вызывал лишь желтую пятнистость листьев, 25 тогда как сильно- и среднепатогенные штаммы вызывали разной степени отставание в росте, желтую пятнистость и пожелте ние листьев .

На растениях перца к группе сильнопатогенных отнесено пять штаммов, которые на 10-й день после заражения вызывали некроз стеблей, а на 15-й день - гибель растений. К группе среднепатогенных отнесено три штамма, которые на 15-й день после заражения вызывали опадение листьев и некроз стебля. Гибель растений перца при этом наступала на 18-20-й день после инокуляции. Ы только штамл F на рас40 тениях перца оказался слаббпатогенным.

На 15-й день после заражения он вызывал лишь опадение листьев, гибель растений не наступала.

Пример 1. Применение штамма

45 Р для получения сыворотки

Для накопления вируса с целью приготовления вирусного антигена используют растения дурмана, которые заражают инфекционным соком, содержащим .

50 штамм F6, полученным из растений картофеля.

Заражение проводят механическим способом с помощью карборунда путем натирания листьев кусочком паралона, смоченным инфекционным соком.

Зараженные растения выращивают в изолированных условиях в секционной теплице. 3а ними проводят уход, который заключается в поливе водопро40160

Концентрация вируса в препарате, мг/мл

Выход чистоШтамм Г-вируса, выделенный из сортов картофеля

10 го виРуса, мг/кг

FÄ (гибрид

Венгрии)

F-„(Ðîзамунда)

F+ (Оме га)

Р, (Эпику-р ) 3,7

10,1

8 1

24,4

0,33

2,10

1,26

2,10

Таблица2

Титр сыворо ток

Сыворотка к штаммам, выделенных с сортов картофеля

Степень пато генно сти штаммов

1:128

1:512

1:256

1: 128

4S

5 15 водной водой, рыхлении почвы в вазо нах и еженедельной подкормке растений смесью Мореля.

Максимальное накопление вируса происходит через 3-4 недели после заражения. Перед срезанием листьев все растения проверяют серологическим методом на наличие Г-вируса и отсутствие других вирусов . Собранные листья охлаждают в .холодильнике и измельчают на мясорубке. Вирус экстрагируют 0,05 И н, трий-фосфатным буфером рН ?,5 (0,5 M хлористого натрия и 0,1Х меркаптоэтанола), Полученную массу отжимают через. двойной слой марли, сок дополнительно охлаждают в морозилке в течение 30 мин, затем добавляют к нему SX бутанола и

1/8 часть хлороформа, Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания жидкостей в сосудах 15 мин, затем центрифугируют 15 мин при 6000 об/мин на рефрежераторной центрифуге, К надосадочной жидкости добавляют 4% ПЭГа с мол. массой 15000 и 1,5% хлористого натрия. Смесь ставят в холодильник на 1,5-2,0 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при

6500 об/мин в течение 15 мин. Полученный осадок ресуспензируют 2-3 раза 0,02 И боратным буфером (рН 7,88,0). Дальнейшую очистку проводят одним циклом дифференциального центрифугирования на центрифуге VAK-601: низкоскоростное 15 мин при

10000 об/мин, высокоскоростное 1,5 ч при 26000 об/мин.

Осадок после экстракции и низкочастотного центрифугирования суспендируют в физиологическом растворе и используют для иммунизации.

Диагностические сыворотки получены к очищенным таким о бразом антигенам четырех изолятов ° Сх=ма иммунизации: одна внутримышечная инъекция с сапонином и через неделю пять внутривенных беэ сапокина с интервалом в два дня. Кровь брали через. 8 дней после последней инъекции.

Все полученные моноштаммовые сыворотки обладают высокой специфичностью. При разведении 1:2 они не реагируют с соком здоровых растений картофеля и дурмана, а также с гетерологичными вирусами картофеля и имеют следующие гомологичные титры с соком растений Яcotiana glutinosa, зараженных изучаемыми штаммами F вируса.

В табл. 2 — приведена характеристиisa сывороток к изучаемым штаммам аукуба-мозаики картофеля, Т а б л и ц а 1

F .(Кордиа)

F . (Эпикур)

F (Гюль8 цев 633) Средняя

Р (Рейнхорт) Сильная

Сыворотка к штамму F< отличалась от сывороток к другим штаммам более высоким титром. Все сыворотки давали перекрестные реакции со всеми имеющимися девятью штаммами вируса аукуба-мозаики.

Пример 2, Получение сывороток к высокоочищенным препаратам вируса аукуба-мозаики.

Листья с зараженных растений

N.rustica через 25 дней после заражения срезают и измельчают через мясорубку с добавлением 1:1 0,1И глицинового буфера (рИ 7,8-8,0), содержащего 0,2Х сульфита натрия, и

0,005И трилона Б. Массу отжимают, полученный сок центрифугируют 20 мин при 12000 об/мин. В надосадочную жидкость добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации 0,5Х и оставляют на холоде 30 мин. Сок центрифугируют 20 мин при ",2000 об/мин, Для концентрации вируса в надосадочную жидкость добавляют 5Х ПЭГ-12000 и 2Х

1640160 8 хлористого натрия. Смесь выдерживают в холодильнике 1,5-2,0 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугиро.ванием при 12000 об/мин в течение

20 мин. Осадок 2-3 раза экстрагируют

0,1М глициновым буфером (рН- 7,8-8,0).

После суспендирования все экстракты объединяют, центрифугируют 15 мин при 5000-6000 об/мин, надосадочную 10 жидкость наносят на 30%-ную сахарозную подушку и центрифугируют 90 мин при 25000 об/мин. Осадок суспендируют

0,1М глициновым буфером (рН 7,8-8,0) и используют для иммунизации. . Схема иммунизации: две внутримышечные инъекции с интервалом в

10 дней в четыре точки по 1 мг препарата и по 0,5 мл неполного адьюванта, Фройнда на 1 кролика. Через 3 недели 20 отдыха проводят четыре внутривенных инъекции с интервалами в два дня: две по 0,5 мг препарата на 1 кролика и две по 1,0 мг. Расход препарата на

1 кролика эа весь цикл иммунизации 25

5,0 мг. Продолжительность иммунизации 38 дней. Кровь берут через 8 дней после последнего введения антигена.

Проиммунизировано по пять кроликов штаммами F< (с сорта Зникур) и F (с ссрта Омега). Сыворотка к штамму Г имела гомологичный титр с соком растения махорки 1:2048, а к штамму У в .1024.0бе сыворотки были специфичными и в разведении 1:2 не давали положительных реакций со здоровыми растениями картофеля и махорки, а также с растениями картофеля, зараженными другими мозаичными вирусами.

Пример 3. Накопления вируса @ и приготовления вирусного антигена используют растения махорки Мсойхааа

rus tica которые заражают штаммом Г по примеру 1. Выращивание растений . махорки осуществляют аналогично примеру 1.

При максимальном накоплении вируса листья махорки собирают, охлаждают в холодильнике и измельчают путем пропускания через мясорубку. Вирус экстрагируют в рабочем буфере, обладающим стабилизирующими свойствами (О,OSN лимонно-кислый трехзамещенный натрий, 0,007М тринол Б и 0,2Х-ный сульфит натрия). Инфекционный сок осветляют путем кратковременного

55 (5-6 мин) эмульгирован ия с охлажденным хлороформом и низкоскоростного центрифугирования в течение 20 мин при 3500 об/мин. Дальнейшую очистку проводят путем гельфильтрации на хроматографических колонках, заполненных гелями на декстрановой основе (молселекты Г-50 и ДЗАЗ-50). Концентрируют вирус 3,5Х-ным полиэтиленгликолем (ПЗГ-15000) в присутствии

0,25N хлорйстого натрия. После одночасового выдерживания вирусного антигена в холодильнике проводят центрифугирование в течение 20 мин при 4000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0,1 исходного объема физиологическим раствором. На всех этапах очистки наличие вируса контролируют иммунологическим методом. Идентификацию вируса в материале, используемом для заражения растений-накопителей, проводят с помощью электронного микроскопа и растений-индикаторов, Для иммунизации кроликов используют антиген с одинаковой концентрацией вируса различных штаммов. Кроликов иммунизируют только свежеприготовленным антигеном путем двукратного внутримышечного введения по 2,5 мл с недельным интервалом и 4-кратного внутривенного введения но 1,2,3 и

4 мл с однодневным инте рв алом. Кровь отбирают на. 7,9 и 11-й день после последнего введения антигена. Получают сыворотку по известным методикам.

После получения сыворотки определяют ее титр и специфичность отдельно по кроликам с гомологичньгм и гетерологичным (Х,S,N,Ó) вирусами картофеля, а также с растительным соком, полученным из здоровых растений картофеля и махорки.

После определения титра делают рабочее разведение сыворотокс учетом титра каждой сыворотки. Приготовленные таким образом сыворотки используют для выявления F-вируса картофеля на различных растениях.

Все полученные нативные сыворотки к различным штаммам обладают высокой специфичностью. При разведении 1:4 они не реагируют с соком здоровых растений махорки и картофеля, а также гетерологичными вирусами картофеля и имеют следующие титры: к штамму

Fg 1:8192, а к известному производственному штамму 1:1024.

В производственных условиях получено пять серий строго специфических высококачественных сывороток к штамму

1640160

Фо рмула изо 6ре тения

Штамм F-вируса картофеля ВИЗР У 18 для получения антигена, используемого при производстве диагностической ааворотки.

Составитель Т. Полянская

Редактор И. Дербак Техред Л. Олийнык Корректор N Демчик

Заказ 997 Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного ком тета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Г . Титр их равнялся (1:2048)(1:8192), что в 4-8 раз выше титра сыворотки к производственному штамму.

Сыворотка к штамму Р готовится

НПО по картофелеводству и рассылается ежегодно в 40-50 учреждений страны ло их заявкам для практического применения ее в семеноводстве картофеля.

В результате испытания было установлено, что штамм F при заражении растений-накопителей (махорка Nicotiana rustica) вызывает симптомы в виде колец или полуколец, окружающих зеленую ткань. Эти симптомы наблюдали на протяжении восьми лет, что указывает на генетическую стабильность штамма.

Таким образом, штамм Fs хорошо накапливается в растениях махорки и дурмана, отличается высокой жизнеспособностью„ имеет наибольший выход чистого препарата вируса и характеризуется высокой антигенной активностью. Титры сывороток, полученных к

,штамму Р, выше в 2-4 раза по сравнению с титрами сывороток к известньм штаммам. Это позволяет без дополнительных затрат на производство увеличить выход сывороток в рабочем разведении в 1,5-2 раза.