Штамм гибридных культивирующих клеток животных mus musculus, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к - субъединице хорионического гонадотропина человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики раннего срока беременности у женщин, диагностики трофобластических опухолей и наблюдения за ходом беременности у женщин из групп риска. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела (Мон-АТ) специфичные к b-ХГЧ. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии X63 Ag 8,653 с клетками селезенки мыши линии BAIB/C, иммунизированной официальным препаратом ХГЧ. В качестве гибридизирующего агента использован ПЭГ 1500. Селекция гибридных клеток осуществляется на среде НАТ, проведены два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки), получено 100% позитивных клонов. Условия выращивания клеток штамма N ВСКК (П) 395 Д: среда RPMI-1640 + 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота, температура +37^oС, газовая фаза - воздух + 5% СО₂. Способ культивирования: в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Тестирование Мон-АТ осуществляют твердофазным иммуноферментным методом с использованием в качестве антигена b-ХГЧ и препаратов гонадотропных гормонов. Через 10-20 дней после инокуляции клеток штамма в брюшную полость мыши линии BAIB/C, обработанной пристаном, получают асцитическую жидкость. Путем высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЕАЕ-52 целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделяют 5-7 мг иммуноглобулинов, содержащих до 90% Мон-АТ, продуцируемых клетками штамма. Мон-АТ реагируют в разведении 1 мкг/мл только с b-субъединицей и цельной молекулой ХГЧ в иммуноферментном и РИА тестах.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики раннего срока беременности у женщин, диагностики трофобластических опухолей и наблюдения за ходом беременности у женщин из групп риска. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела Мон-Ат, специфичные к β-ХГЧ. Штамм получают следующим образом. В качестве антигена используют официальный препарат ХГЧ. Мышей линии ВАlВ/С иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в 1-й день 500 ед. препарата в смеси с полым адъювантом Фрейнда (ПАФ), на 14-й и 28-й дни вводят по 250 ед. препарата с ПАФ, реиммунизируют мышь на 56-й день вводят 2500 ед. ХГЧ в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия. Через 72-96 ч после реиммунизации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию клеток (спленоцитов). Клетки селезенки мыши линии ВАlВ/С, иммунизированной препаратом ХГЧ, сливают (гибриди- зируют) с клетками мышиной миеломы Х63 Аg 8.653. Сливают агент ПЭГ 1500 (50%-ный раствор). Селекцию гибридных клеток проводят на среде НАТ, два клонирования методом лимитирующего разведения (одна клетка на 3 лунки), 100% позитивных клонов. Стандартные условия выращивания. Среда RPMI 1640 + 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (ЕСS), газовая фаза воздух + 5% СО₂. Способ культивирования: в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза 500000 клеток в 1 мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. В организме животного мышь линии ВАlВ/С, обработанная пристаном (0,5 мл внутрибрюшинно за 5-10 дней до инокуляции), доза инокуляции 3-8 млн. клеток, время образования асцита 10-20 дней. Полученный штамм гибридных клеток мыши обозначен Ф 12. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток Всесоюзной коллекции клеточных культур под NВСКК (П) 395 Д и характеризуется следующими признаками. Данные видовой принадлежности: мышиные клетки линии ВАlВ/С. Гибридома секретирует МкАт против β-ХГЧ, определяемые иммуноблоттингом, иммуноферментными, иммунофлоуресцентными и радиоиммунными методами. Контаминации бактериями и грибами нет, микоплозмы не обнаружены. Штамм гибридных клеток продуцирует моноклональные антитела lgG, класса, направленные против β-ХГЧ, специфичность оценивается иммуноблоттингом, иммуноферментными, иммунофлуоресцентными и радиоиммунными методами. Концентрация полезного продукта МкАт против β-ХГЧ в культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитической жидкости около 7 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью иммуноферментного метода 1:3000 в культуральной среде и 2 x 10⁵-10⁷ в асцитической жидкости, при нанесении на плейты антигена в концентрации 30 ед/мл препарата ХГЧ. Продукция МкАт стабильна по крайней мере в течение 30 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома перевивается на мышах ВАlВ/С. Способ криоконсервации. 4 x 10⁶ клеток в RPMI 1640 + 10% FCS + 10% ДМСО, замораживание в пенопластовой коробке при -70^оС. Жизнеспособность после размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности по исключению трипанового синего после 24 ч культивирования). Ниже приведены примеры использования штамма гибридных клеток NВСКК (П) 395 Д. П р и м е р 1. При использовании гибридомы получены специфические к β-ХГЧ МкАт путем выделения их из асцитической жидкости мыши ВАlВ/С. С помощью высаливания сульфатом аммония и последующей ионообменной хроматографии на колонках с ДЕАЕ-52 с целлюлозой из 1 мл асцитической жидкости выделено 6,9 мг МкАт анти- β-ХГЧ. Контроль на специфичность МкАт проведен в системе твердофазного иммуноферментного анализа. МкАт реагируют только с β-ХГЧ и цельной молекулой ХГЧ в разделении 1 мкг/мл. МкАт не реагируют ЛГЧ, ФСГЧ, ТТГЧ, а также с ЛГ и ФСГ свиньи, коровы, лошади и ХГ лошади. П р и м е р 2. Продуцируемые штаммом МкАт к β-ХГЧ использованы для разработки системы твердофазного иммуноферментного анализа, в которой МкАт анти- β-ХГЧ фиксировались (сорбировались) на пластинках для иммунологических исследований отечественного производства. В качестве конъюгата МкАт с пероксидазой использованы МкАт к другому эпитопу β-ХГЧ. Чувствительность двухсайтовой иммуноферментной системы на основе двух МкАт к β-ХГЧ 40-50 МЕ/л. Эта тест-система позволяет выявлять ХГЧ в моче женщин, начиная с 8-10 дня после оплодотворения, т. е. обеспечивает раннюю диагностику беременности.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus N ВСКК (П) 395 Д, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к b -субъединице хорионического гонадотропина человека.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 32-2000

Извещение опубликовано: 20.11.2000        

---