Способ биотестирования токсичности промышленных сточных вод

 

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦЮЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 " "1 11 33/18

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕНКЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) i)686150/13 (22) 03.0>.89 (ч6) 1>.10.31. Бюл, t 38 (71) !(Уйбышевский медицинский институт им. Д.И. Ульянова (72) И.Ф. Ыаталаев, Т.Б. Волгина, Е.В. Цеголева и С.U. Первушкин (53) >86.1(058.8) (56) Авторское свидетельство СССР и 93Ч323, кл. Г 01 П 33/18 1977. (5ч) СПОСОБ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ТО1(СИЧНОСТИ ПРОНБ1ИЛЕННЦХ СТОЧНЫХ ВОД (57) Изобретение относится к биологической очистке промышленных сточных вод, может быть использовано для установления токсичности сточных вод отИзобретение относится к биологической очистке промышленных сточных вод, может быть использовано для установления токсичности сточных вод отдельных производств, индивидуальных компонентов и многокомпонентных систем загрязнителей при приеме на биологическую очистку и выбросе в водоемы, а также для оперативного контроля за работой сооружений биологической очистки, Гжель изобретения - увеличение точ" ности и чувствительности способа био" тестирования токсичности сточных вод промышленных производств и их компонентов путем устанонления нарушения способности >елков микроорганизмов экосистемы активного ила связывать

„„SU„„1684664 А 1 дельных производств, индивидуальных компонентов и многокомпонентных систем загрязнителей при приеме на 6«oRnr ec ye очистку и выбросе в водоемы, а также для оперативного контроля эа работой сооружений биологической очистки, Цель изобретения - увеличение точности биотестирования, Проводят электрофоретическое разделение белков микроорганизмов экосистемы активного ила с последующим окрашиванием электрофореграмм амидо чернью, удалением избытка красителя и визуальной оценкой нарушения фиксации красителя фракциями белка при действии токсичных компонентов сточных вод промышлен- а ных производств различных концентраций. 6 табл. специфический краситель при действии токсичных сточных вод и их компонен" тов.

Способ осуцествляат следующим образом. В колбы помецают по 200 мл иловои суспензии действуюцих очистных Ж сооружений. Одну колбу оставляют в Ф качестве контроля, в другую(ие) до- ьФ бавляют различные количества сточных вод (10 - 0 мл е зависимости от вероятной токсичности).или компонентов 3 сточных вод в разных концентрациях. (олбы помецают на магнитные мешалки и, перемешивая, проводят инкубацию в те- чение 1 ч при 37 С. Продолжительность и температура инкубации установлены в результате оптимизации условий эксперимента. По окончании 1нкубации иэ

1684664 контрольной и опытных образцов берут по 10 мл иловой суспенэии, трехкратно промывают фосфатным буферным раствором рП 7,0, центрифугируют при

3000 об/мин 10 мин. Осадок переносят в механический деэинтегратор (стеклянцентрации. 1(олбы помещают на магнитные!

25 мешалки и продолжают дезинтеграцию в

o .. течение 2 ч при 37 С. Дезинтеграт центрифугируют при 3000 o6/мин в те:.чение 10 мин, таким образом псл.:.ают супернатан-., содержащий белки ьикроорганизмов экосистемы активного игIh.

Далее в супернатанте определяют обций белок по Биурету или йо Лоури и фракции белков методов электрофореза в

l 1<ских блоках полиакриламидного геля. Для э огo анализируемые образць1 в. бъеме q0 мкл в смеси с 401-ным раст.: Ipo:, сахзрозы наносят на линию стар, . В кач .стве электродного буфера исг ользуюг 1 М трис-ЭД ГД-боратный буФео рН",2, Электрофорез проводят при силе тока q,0 мА/см в первые 30 мин, 30 затем 10,0 мА/с.м до окон"ания элекгроФореза. Полученные Фракции белков окрашивают и Фиксируют, для чего электрофореграммы помещают в 1 -ный раствор амидо черного в 7 .; уксусной кис35 лоте на 1 Э мнн удаление избытка красителя г1роаодят выма чива нием гелевых пластинок в 7 .-ном растворе уксусной кислоть. Для ускорения обесцвечивания

40 фона раствор уксусной кислоты меняют

4 раза в день, Экспресс-окрашивание и фиксацию электрофореграмм проводят следуюцим способом: по окончании электрофореэа катодную <амеру прибора заливают

1 .:-ным раствором амидо черного в 7 уксусной кислоте и продолжают процесс oреза в течение 10 мин,После скрашивания гелей раст гор красителя заменяют 73-ным раствором уксусной кислоTbl и продолжают электрофорез до полного удаления Фонового окpaIIIивания.

Для ка-IecTBeHHGIl оценки действия токсичных сточных вод и их компоненTGB на белки микроорганизмов активног0 ила достаточно визуальногo исследования электрофореграмм без денсито,.; — 1 i.I

55 ная ступка и пестик на шлифах), дезинтеграцию проводят в течение ) мин при 4 С. Дезинтегрируемую иловую смесь10 переносят в колбу, добавляют 5 мл фосФатного буферного раствора рП 7,0 и тритона X-1 00 20 мг./мл в конечной конДействие минимальных токсичных концентраций компонентов сточных вод приводит к изменению электрофоретической подвижности фракций белка по сравнению с контролем, причем фракции выявляются в зиде "подков с зубчиками на краях".

Такие качественные изменения белковых фракций указывают на начало токсического действия сточных вод и их компонентов на микроорганизмы экосистемы активного ила, Увеличение концентрации токсичных компонентов сточных вод ведет к постепенному увеличению нарушения фиксирования белками специфического красителя вплоть до полного исчезновения окрашенных фракций с поля электрофореграмм. Причем общее количество белка в образцах и в контроле и в опытах остается примерно на одном уровне.

П р и и е р 1. В 4 колбы помецают

> пс 200 мп илоной суспенэии 1-й ступеl-lv биологической очистки сточных вод.

Одну колбу оставляют в качестве контроля, I остальные добавляют по 50 мг/г ила, 100 мг/г ила и 150 мг/г ила синтетического моюцего средства "Прогp< .cc". I(укаэанному детергенту активный ил адаптирован. (олбы помещают на магнитные мешалки и при перемешивании проводят инкубацию в течение 1 ч при

) С. Получение образцов, электрофоре= и выявление белковых фракций проводят вышеописанным способом, Данные экспериментов по известному и предлагаемому способам представлены в табл, 1 и 2 соответственно.

Из данных, полученных известным способом видно, что при действии СИС

"(1рогрессн в концентрации )О мг/г ила снижение обцей активности дегидрогенаэ происходит на 16, Я к контролю, что указывает на отсутствие токсического влияния на микроорганизмы активного ила. Иэ данных предлагаемого способа видно, что при действии СМС Прогресс" в концентрации 50 мг/г ила выявляется 3 Фракции белка, однако сни качественно отличаются от фракций а электрофореграммах контрольных образцов появлением "зубчиков" на краях Фракций, изменением формы и электрофоретической подвижности. Укаэанные признаки являются характерными для

1онсическо"o действия СИС такой концентрации на микроорганизмы экосисте" мы активного ила. Действие концентраО4664

5 16 ции 100 мг/г ила приводит к уходу одной фракции с поля электрофореграмм, а действие 150 мг/г ила приводит к исчезновению с поля электрофореграмм всех трех фракций белка. Количество общего белка по Лоури остается примерно на одном уровне во всех сериях экспериментов и в контроле и в опыте, Данные укаэанной серии экспериментов говорят о более высокой чувствительности предлагаемого способа по сравнению с известным, Пример 2.

В 2 колбы помещают по 200 мл иловой суспензии 1-й ступени биологической очистки сточных вод. Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую добавляют 120 мг/г ила аммиака, залповые выбросы которого характерны для данного производства. Колбы помещают на магнитные мешалки и при перемешивании проводят инкубациа в течение 1 ч при 37 ". Получение образцов, электрофорез и выявление белковых фракцлй проводят аналогичным образом.

Данные экспериментов по известному и предлагаемому способам представлены на табл. 2 и 3 соответственно.

Данные эксперимента, полученные известным способом, указывают на вы° раженную -токсичность аммиака в такой концентрации по отношению к микроорганизмам ила (снижение исходной активности дегидрогеназ на 40,14) . Из данных предлагаемого способа видно, что залповый выброс аммиака в такой концентрации приводит к исчезновению всех трех фракций с поля электрофореграмм, что указывает на острую токсичность для экосистемы активного ила.

Эта серия доказывает, что предлагаемый способ значительно чувствительнее известного, Пример 3. В 2 колбы помещают по 200 мл иловой суспензии 1-й ступени биологической очистки сточных вод.

Одну колбу оставляют в качестве контроля, в другую доЬавляют 150 мг/r ила нормальных парафинов, также характерных для сточных вод укаэанного производства. Колбы помецают на магнитные .мешалки и при перемешивании проводят ,,инкубацию в течение 1 ч при 37 С. Поо лучение образцов, электрофорез и выявление белковых фракций проводят в той .же последовательности, что и в предыдущих примерах. Данные экспериментов пр: дставлены на табл. q и 6 соответ- ственно.

Из данных табл. > видно, что по из5 вес тному способу н-парафины в исследуемой концентрации не токсичны по отношению к микроорганизмам активного ила . Серия, проведенная предла га емым способом, показывает, что из трех фракций, выявленных в контрольных образцах, при действии и-парафинов выявляется только одна фракция белка с

"зубчиками на краях", что указывает на выраженное токсическое действие указ, нного компонЕнта на активный ил, Это еще р33 подтверждает большую чув-; ствительность предлагаемого способа

Применение заявляемого способа био20 тестирования токсичности промышленных сточных вод позволит с большей чувствительностью установить минимальные концентрации ко лпонентов сточных вод, при которых начинается токсическое действие на микроорганизмы экосистемы актионого ила, и концентрации, KQToрые действуют на активный ил остро токсично.

Использование спосоЬа на сооруже30 ниях Ьиологической очистки сточных вод промышленных преизводств, городских станций аэрации, отраслевых НИИ и службах биомониторинга обеспечит санитарный эффект за счет оперативного контроля состояния сточных вод при приеме на биологическую очистку и выбросе в водоемы, сделает более действенным управление технологическим процессо л очистки стоков, 40 ° ,Фор лула изобретения

Способ биотестирования токсичности промышленных сточных вод, предусматриваюций отбор проб микроорганизмов экосистемы активного ила, их инкубацию с компонентами сточных вод различных концентраций, последующее центрифугирование, окрашивание белковых об,разцов и отнесение исследуемых компо нентов сточных вод к токсичным по из менению интенсивности окрашивания опытных образцов,.отличающийся тем, что, с целью повышения точ55 ности биотестирования после инкуба«.

t ции проводят дезинтеграцию микроорга" низмов активного ила, центрифугирова1 ,ние и электрофорез полученных Ьелкоаых образцов в плоских блоках полиак1684664 кт рофоретической подвижности фракций белка и нарушению фиксирования красителя Фракциями белка в опыте по сравнению с контролем. риламидного геля с последующим окрашиванием фракций ЬеЛка специфическим красителем, а интенсивность окрашивания оценивают по изменению формы, зле-

Таблица 1

) 50 мг CtlC/ã ила 100 мг/г ила 150 иг/г ила

Контроль

1,48+0,10

-45

2,67+0,11 ,Снижение, 4

2, 23+0,13

-16, 5

1, 7 +0, 09

-33,0

Табли ца 2

Опыт (СИС "Прогресс", мг/г ила) Контроль

Фракции Общий Фракции белка белок оелка

Общий Фракции белок белка

Общий белок

100

150

7,4

6,8

7,1

8 9

7,9

7,8

7,5

7,6

6,6

0,1

Табли ца 3

Известный способ

Обцая активность дегидрогеназ активного ила, мг Формазана/r ила

Опыт (120 мг аммиа" ка/г ила) Контроль

2,67 .

+О, 11

Снижение, 34

Таблица 4

Опыт (аммиак, 120 мг/г ила) Контроль

Общий белок Фракции белка йо Лоури„ (количество) мг/мл

Фракции белка (кол-во) Обций белок по

Лоури, мг/мл

8,1

8,0

9,4

7,3

7,8

Общий белок по

Лоури, мг/мл

7,2

6,8

8,3

9,1

ii, 7

Фракции белка, кол во

8,5

7,7

10,2

7,0

8,2

1,59

+0,08

-40,1

7,4

7,0

7,5

6,0

7,9

1684664

Таблица 5

Общая активность дегидрогена з а кти вного ила, мг форма за на/г

Опыт (150 мг н-парафинов/г ила) Контроль

2,67

+О, 11

Снижение, 4

Таблица 6

Опыт (н-парафин, 150 мг/г ила) Контроль фракции белка (количество) Общий бе" лок поg

Лаури мг/мл

I,О

Составитель О. Корженко

Техред Л.Сердюкова Корректор Л. Пилипенко

Редактор В. Трубченко

Заказ 3502 Тираж Подписное

РНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина, 10!

8,5

7,7

10,2

Фракции белка, кол-во

2,56

+0,14

:4,0

Общий белок по Лоури, мг/мл

7,9

7,6

9,1

8,0

8,2

1

1