Способ определения концентрации суспендированных клеток эллипсоидальных и палочкообразных форм

 

Изобретение относится к области определения концентрации клеток в суспензии и может использоваться в микробиологии, медицине , биотехнологии. Цель изобретения - повышение точности измерения концентрации клеток по результатам измерения величины оптической плотности суспензии. Для этого на суспензию клеток последовательно воздействуют перпендикулярным и параллельным направлению светового потока электрическим полем, определяют стационарные значения изменения оптической плотности после выключения электрического поля и рассчитывают среднее значение показателя экспоненты. Концентрацию клеток рассчитывают по среднему значению показателя экспоненты и отношению стационарных изменений оптической плотности. 1 ил., 1 табл. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (ss>s G 01 N 21/47

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР t

Ь

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4702820/25 (22) 09.06.89 (46) 07.11.91. Бюл. N 4 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) В.Д.Бунин и А.Г.Волошин (53) 535.361 (088.8) (56) Garia de la Torre, Bloomfield U.À.

Hydrodinamic properties of complex, rigid, biological macromolecu1es. — Quarterly

rewlews of biophysics; 1981, 14, 1, р, 31 — 139.

Методы общей бактериологии,/Под ред, Ф.Герхарда. Т. 1 — М.: Мир, 1984, гл. 3.

» (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИ И СУСП Е НДИ РОВАН Н ЫХ КЛ ЕТОК

ЭЛЛИПСОИДАЛЬНЫХ И ПАЛОЧКООБРАЗНЫХ ФОРМ

Изобретение относится к области определения свойств дисперсных сред, а именно к определению концентрации клеток в суспензии, и может быть использовано в микробиологии,медицине и биотехнологии.

Целью изобретения является повышение точности измерений.

На чертеже изображена электрооптическая ячейка, используемая для определения электрооптических сигналов, сечение.

Ячейка имеет полость 1, заполняемую исследуемой суспензией, корпус 2, оптические окна 3 и 4, электродную систему из. Ж, 1689807 А1 (57) Изобретение относится к области определения концентрации клеток в суспензии и может использоваться в микробиологии, медицине, биотехнологии. Цель изобретения— повышение точности измерения концентрации клеток по результатам измерения величины оптической плотности суспензии, Для этого на суспензию клеток последовательно воздействуют перпендикулярным и параллельным направлению светового потока электрическим полем, определяют стационарные значения изменения оптической плотности после выключения электрического поля и рассчитывают среднее значение показателя экспоненты. Концентрацию клеток рассчитывают по среднему значению, показателя экспоненты и отношению стационарных изменений оптической плотности.

1 ил„1 табл. четырех параллельных равноудаленных проводов 5 — 8, которые подключены к генератору, Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемую суспензию помещают в электрооптическую ячейку. Проводят измерение оптической плотности суспензии без воздействия электрического поля. Измеряют стационарные значения S> и Sz электрооптического сигнала, представляющего собой приращение оптической плотности суспензии воздействия на нее электриче1689807

Входящая в М! константа К включает в себя константы L, К1, К2, Кз и зависит от длины волны света, относительного коэффициента и преломления клетки. Она рассчитывается

5 аналитически или определяется при условии постоянства и опытным путем.

При расчете величины Mz(p) неизвестный параметр р определяется из соотношения 81/S2:

10 (7) U! = Fz(p,U)jU =-О, Uz = F2(p,u)iu = 90, Аналитические соотношения для опре20 деления F1 и Fz клеток эллиптической и палочкообразной форм следующие.

F1 = n(p) — 0,6621 + 1/р (эллипсоидал ьная форма)

F1 =- n(2p) — 0,5 (палочкообразная форма);

Ss(t) =- ехр (--GR<), (1) R — — K!F1(p)/b, (2) где К! — константа;

Ь вЂ” продольный размер клетки;

F1(p) — функция эксцентриситета клеток 30 где Л вЂ” длина волны падающего света;

35 и — коэффициент преломления частицы.

Пример 1. Измерение концентрации бактерий различных типов.

Клетки Мс,luteus, Вес, purnilis.

40 Вас.globigil, Вас,subtills выращивали на мясопептонном бульоне в течение 4 ч в колбах.

После выращивания клетки отделяли от культуральной жидкости методом фильтрации. Осадок ресуспендировали в трис-цит45 ратный буфер с удельной электропровод«остью 10 2 1/Ом М, Оптическая плотность суспензии микроорганизмов, используемой для определения оптических параметров и концентрации

50 (титра) бактерий, равна 0,5 (il=- 540 нм, ! = 10 мм).

Электрооптическую ячейку с суспе«зией клеток помещали в спектрофотометр

СФ-26. Определяли изменение оптической

55 плотности суспензии при воздействии на нее перпендикулярного и параллельного вектору светового потока электрического поля от генератора ГЗ-154. На самописце регистрировали форму кривой изменения (4) G =- Kzb Fz(p,u), M1(R) .— KR (5) ) л/" /f(i. (р)1/3 Г ()) (6) -.ко о поля частоты от 100 кГц до 5 кГц при

«апряже«ности 1000-5000 В/м. Значение

S1ппределяют при коллинеарности вектора электрического поля и направления падения светового потока, а значение S2 — при их перпендикулярности. Напряженность электрического поля в исследуемой суспензии при этих измерениях должна быть неизмен«ой. Выбор направления вектора электрического поля коллинеарно или перпендикулярно световому потоку соответственно достигается при соединении электродов5с7 и 6 с8 или 5сби7с8 при подключении к этим группам электродов клемм генератора гармонического напряжения, Сигнал Sg(t) представляет собой измеHpíèe оптической плотности суспензии при переходе клеток из ориентированного в дезориентированное состояние и зависит от з«ачения коэффициента R вращательной диффузии клеток:

Вывод расчетной формулы для нахожде«ия корректирующего коэффициента M основан на определении усредненного сече«ия рассения клеток G по результатам электрооптических измерений с выделени ем сомножителей М1 и М2. Соотношение, для определения концентрации N клеток по оптической плотности Г) имеет вид

N = LD/G — LDM . LDM1M2, (3) где L — величина, обрат«о пропорциональная оптической толщине ячейки.

При этом где Kz — ко«ста«та;

Fz(p,u) — функция эксцентриситета р и угла и между «вправлением падения светового потока и продольной осью клетки.

Г!одста«овка соотношений (2) и (4) в (3) позволяет выделить входящие в (3) коэффицие«ты:

S1/S2 = (01 Uo)/(Uo 02), ГдЕ Uo = F2(p,u) . Sin (u) du, Fz = W (1 — 2sin u/u+ 2(1 — cos u)/u, W = р з(1 — (1 — рр) cos и), u = 4Л г(n — 1)/2, „, / 1/З

1689807

Вид микроооганиэмон

Г зкаэатели

11С lureus Bac. pumilis Bac. globigii Вас. subcilis

Средний продольнь,< раэмер H {микрофотографии) r x

3,3G

Эксцентриситет р (микрофотографии) 4

Нонцентрация клеток . 1 на намере Горяева, " 1

8,2

Нцэффициент Г. вращательной диффуэии (30 иэмерения1, 1i

fc.

;с множитель, К,i 10 и, 55

3 02

4,15

18, G

4,38

Отношение электрооптичесних сигнался для продольной и попер-: чной ориентации клетон S1(S2

1,:"3

1,07

1,18

Расчетная ееллчи,;; многожителя 1> < 1", 17,3

5Z,8

4,»Л

Нонцентрация клеток К по результатам эл HTDo— оптических иэмерсн й

7,21

-3,? и,3 оптической плотности после выключения электрического поля. Согласно формуле (1) по форме кривой определяли величину R.

Рассчитывали концентрацию микроорганизмов по формулам (2), (4), (5) и (6).

Для сравнения концентрацию микроорганизмов определяли с помощью камеры Горяева. Средний продольный размер и эксцентриситет бактериальных клеток определяли по микрофотографиям 500 клеток.

Результаты сравнения измерений представлены в таблице, Способ снижает погрешность при измерении концентрации в 5-8 раз, Достоверность измерений подтверждается сравнением с результатами, полученными на камере Горяева.

Способ может быть использован при контроле процессов культивирования клеток, для производства биопрепаратов, получения низкомолекулярных метаболитов и биологически активных веществ.

Нонцентрация нлеток l1, рассчитанная по огтическои плотности 1ОВ 1, >

Формула изобретения

Способ определения концентрации суспендированных клеток эллипсоидальных и палочкообразных форм, заключающийся в

5 том, что направляют на суспензию световой поток, измеряют оптическую плотность суспенэии при воздействии электрического поля, отличающийся тем, что, с целью повышения точности измерения, на суспен10 зию последовательно воздействуют перпендикулярным и параллельным направлению светового потока электрическими полями и определяют стационарные значения изменения оптической плотности, 15 регистрируют форму кривой изменения оптической плотности после выключения электрического поля и рассчитывают среднее значение показателя экспоненты, а концентрацию клеток рассчитывают по среднему

20 значению показателя экспоненты и отношению стационарных изменений оптической плотности.

1б89807

Составитель Л.Закс

Техред М.Моргентал Корректор M.ØàðoUjè

Редактор М.Товтин

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3807 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5