Способ криоконсервации спермы

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к технологии искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и птиц. Целью изобретения является повышение выживаемости и оплодотворяющей способности семени. Способ заключается в использовании в качестве криопротектора соединения, которое относится к классу N-ацилэтаноламинов: N-пальмитоилэтаноламина и/или N-стеароилэтаноламина, который предварительно смешивают с липофильным компонентом защитной среды в соотношении 1:1000. Затем полученную смесь вводят в разбавленную сперму из расчета 50-100 мкг на 1 млрд спермиев. Выживаемость спермиев достигает 8,5 ч, а оплодотворяющая способность спермы 64,8%, 1 з.п.ф-лы, 2 табл. (Л

союз советсних

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (® A 01 N 1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Х А ВТОРСИОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОсудАРстВенный нОмитет

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГиям

ПРИ ГННТ СССР (21) 4221514/15 (22) 01.04.87 (46) 15.11.91. Бюл. 42 (71) Институт биохимии им.А.В.Палладина и Украинская сельскохозяйственная академия . (72) Н.М.Гулая, Г.Л.Волков, М.В.Высоцкий, Д.А.Мельничук и d>.Â.Èâàíåímo (53) 591 391. 1 (088. 8) (56) Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий Ilo искусственному осеменении животных. М ° ; Колос, 1981, 36 с. (54) СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к технологии искусственного осеменения сельИзобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к техноло,гии искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и птиц.

Цепью изобретения является повышение выживаемости и оплодотворяющей способности семени.

Способ заключается в использовании в качестве криопротектора соединения, которое относится к классу N-ацилэтаноламиноя: N-пальмитоилэтаноламина (D3A) и/или М-сгеароилэтаноламина (СЭ ), представляющих собой поверхностн -активные вещества °

Фармокологичес кое действие этих препаратов изучено, например, ПЭР

,как фармацевтический препарат им.пульсин применяется в Чехословакии

„„Я0„„1690736 А 1

2 скохозяйственных животных и птиц.

Целью изобретения является повыше-, ние выживаемости и оплодотворяющей способности семени. Способ заключается в использовании B качестве криопротектора соединения, которое относится к классу N-ацилэтаноламинов:

N-ïàëüìèòîèëýràíîëÿìèíà и/или N-стеароилэтаноламина, который предварительно смешивают с липофильным ком понентом защитной среды в соотношении 1:1000. Затем полученную смесь вводят в разбавленную сперму из расчета 50-100 мкг на 1 млрд спермиев.

Выживаемость спермиев достигает

8,5 ч, а оплодотворяющая способность спермы 64,83, 1 з.п,ф-лы, 2 табл. для лечения острых респираторных за" болеваний вирусной природы.

Способ осуществляют следующим образом.

I0 мг ПЭА и/или СЭА растворяют при тщательном перемешивании в

10000 мг липофильного компонента за- щитной средь1. Свежеотобранную сперму оценивают согласно известному базо-, вому способу и в зависимости от концентрации спермиев в нее вводят защитную среду, а затем добавляют криопротекторную смесь 50-100 мкг на 1 млрд спермиев и перемешивают, эквилибруют при 0-(+5) в течение о

4-5 ч и замораживают в парах жидкого азота до температуры (-196) С.

Пример 1. Приготовляют криопротекторную смесь для 20 проб.

1690736

10 мг ПЭА смешивают с 10000 мг яичного желтка (в соотношении 1:1000).

Цельную сперму разбавляют в защитной среде из расчета 10 млн активных спермиев в одной оттаянной спермодозе при следующем составе среды:

Лактоза, г 11,5

Желток куриных яиц, мл 20,0

Глицерин, мл 5,0

Спермосан - 3 ть!с.ер. 50,0

Вода дистиллированная, мл 100 0

В разбавленную сперму вводят смесь с криопротектором из расчета 75 мг смеси на 1 млрд спермиев. Затем обработанную сперму охлаждают в холоо дильнике до 5 С в течение 5 ч (эквилибрация) и замораживают в виде гра-20 нул на Фторопластовой пластине в парах жидкого азота. Замороженную спер0 му хранят в жидком азоте при (-196) С.

Одновременно параллельные пробы тех же эякулянтов обрабатывают по базо- 25 вому способу, которые служат кбнтролем.

Биологическую полноценность спермы, обработанной базовым и предлагаемым способами, оценивают по показателям подвижности и выживаемости спер-, миев согласно ГОСТУ 20909,4-75. Результаты проведенных исследований изложены в табл.l.

Пример ы 2-6. Сначала приготовляют криопротекторную смесь ПЭА и/или СЭА в глицерине (1:1000) в следующих количествах на 1 млрд спермиев; пример 2. 50 мг смеси (50 мкг ПЭА 40 в 50 мг глицерина), пример 3. 75 мг смеси (75 мкг ПЭА в 75 мг глицерина); пример 4. 75 мг смеси (75 мкг СЭА в 75 мг глицерина);

45 пример 5. 75 мг смеси (37,5 мкг

ПЭА+37,5 мкг СЭА в 75 мг глицерина) пример 6. 100. мг смеси (100 мкг

СЭА в 100 мг глицерина).

Цельную сперму разбавляют защитной средой из расчета 10 млн активных спермиев в одной оттаянной спермодозе при следующем составе защитной среды:

Лактоза, r 11,5

Желток куриных яиц, мл 20,0

Глицерин, мл 5,0

Спермосан (3 тыс.ед.) 50,0

Вода, дистиллированная, мл 100,0

Пример 7. Определяли биологическую полноценность спермы, полученной при применении предлагаемого способа, путем искусственного осеменения коров и телок на небольшом поголовье в колхозах "Зоря" и

"Здобуток Яовтня" Житомирского района Житомирской области УССР. Контролем служила сперма быков-производителей, замороженная по базовому способу. Зависимость оплодотворяющей способности спермы от способа ее криоконсервации приведена в табл.2. Контроль оплодотворения осуществляли ректальным исследованием.

Анализ полученных результатов свидетельствует о преимуществах нового способа по сравнению с известными, которые выражаются в более высокой биологической полноценности спермы.

Полвижность спермиев увеличивается на 59,54 при статистически значимой разнице в сравнении со способомпрототипом. Значительно увеличивается абсолютный показатель выживаемости (на 854) при одинаковом времени выживаемости спермиев.

Кроме того, высокий процент оплодотворяемости коров {64,84} и телок (90,2"ь) спермой быков-производителей, замороженной предлагаемым способом,против базового (48,74 и

76,94 соответственно, табл.2) свидетельствует о биологической полноценности спермиев при обработке спермы животных предлагаемым способом.

Формула изобретения I, Способ криоконсервации спермы, включающий разбавление спермы защитной средой, содержащей липофильный компонент и обработку криопротектором, эквилибрацию, замораживание в парах жидкого азота и оттаивание, отличающийся тем, что, с целью повышения выживаемости и оплодотворяющей способности семени, в качестве криопротектора используют

N-пальмитоилэтаноламин и/или Н-стеароилэтаноламин, который предварительно смешивают с липофильным компонентом защитной среды в соотноше-»; нии 1:1000, а затем полученную смесь вводят в разбавленную сперму

1bg0/36 из расчета 50-100 мкг на 1 ° млрд спермиев

2. Способ по п.l, о т л и и а юшийся тем, что в качестве липофильного компонента используют глицерин или яичный желток.

Табли ца о

Выживаемость при 38 С

Время, ч Абсолютная

Способ обработки

Пример

Подвижность, балл

Количество эякулятов (n3

1 в**15

n=20

3 п20

4 а *20

5 в 20

6 и - 20

П р и и е ч а н и е, Введение смеси в количестве 10-40 мкг на 1 млрд спермиев " увеличивает абсолютную выживаемость всего на 30-403, а . введение 200-500 мкг — не увеличивает ее более чем т на 60-6«Ж.

Табл и ца 2

Способ обработки спермы

Осеменено голов

Оплодотворено от первого осеменения голов

35 64,8

37 90,2

37 48,7

90 76,9

54

41

76

117

Предлагаемый коровы телки

Базовый коровы телки

Составитель И.Марченко

Редактор И.Васильева Техред А,Кравчук

Корректор И,Самборская

Заказ 4619 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5 г

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.у кгород, ул. Гагарина,101

Предлагаемый

Базовый

Повышение, Предлагаемый.

Базовый

Повышение, 9, Предлагаемый

Базовый

Повышение, Предлагаемый

Базовый

Повышение, Предлагаемый

Базовый

Повышение, ф

Предлагаемый

Базовый

Повышение, Ж

8, 26 -0, 1 19

4,66+0,124

77,25

6,82+0,168

4,66+0,124

46,35

8,23+0,207

4,66+0,124

76,61

P,,08e0,?68

4,66+0,124

73,39

8,37+0,194

4,66+0,124

79,61

6 17+0,113

4,66+0,124

«2,40

8,19+0,533

5,63+0,168

45,"7

7,69+0,235

5,63+0,168

36,59

8,42i0,369

5,63+0, 168

49,56

8,3!+0,490

5,63+0,168

47,60

8,2 1з.О „367

5,63+0,168

45,8«

7,53+0,281

5,63+0,168

33,75

44, 3 1+1, 923

22, 11+1, 487

-f 00,4 l

36,24+2,177

22, 11+1,487

63,91

43,92+2,615

22, 11+1, 487

98,64

44,07+?,708

22, 11+1,487

99,32

44,00+0,193

22, 11+1,487

99, 00

35,97+2,238

22, 11+1,487

62,69