Способ диагностики ретинобластомы у детей
Изобретение относится к онкоофтзльмологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики ретинобластомы. Целью изобретения является упрощение способа, снижение осложнений и повышение за счет дифференциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевой патологии глаза. Цель достигается тем, что включают иммунологическое исследование больного по реакции гиперчувствительности замедленного типа с помощью водно-солевого экстракта из клеток ретиноблзстомы. Новым в способе являются постановка теста In vitro и определение миграционной способности лейкоцитов периферической крови с использованием водорастворимых антигенных препаратов из биопсийного материала ткани ретинобластомы, содержащих полипептиды с мол.м. 50-100 кД в концентрации 100-200 мкг в мл в интервале 16-22 ч от начала реакции миграции. Способ позволяет повысить точность дооперационной диагностики как поздних, так и ранних стадий развития ретинобластомы у первичных больных, обнаружить развитие опухоли сетчатки другого глаза после удаления худшего глаза по поводу ретинобластомы. снизить травматичность и возможность осложнений. (Л С
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (st)s G 01 N 33/53 ГОСУЛАРCTBE ННЫЙ KOMi1TET ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -" ::О К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4716767!14 (22) 10.07.89 (46) 07.01.92. Бюл. ЛЬ 1 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) И.Б.Каргина, О.А.Скрябина и А.B.Õâàòoâà (53) 615.375(088.8) (56) Amer. I.Ophtalmol, 1976, к 81 1 в 2, р, 129-146. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕТИНОБЛАСТОМЫ У ДЕТЕЙ (57) Изобретение относится к онкоофтальмологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики ретинобластомы. Целью изобретенИя является упрощение способа. снижение осложнений и повышение за счет дифференциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевой патологии глаза. Цель достигается тем, что включают иммунологическое исследование Изобретение относится к медицине, а именно к онкоофтальмологии. и может быть использовано для дифференциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевых поражений глаза. Целью изобретения является упрощение способа, снижение осложнений и повышение точности путем дифференциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевой патологии глаза. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа проводят In vitro и определяют миграционную способность лейкоцитов периферической крови с использованиемм водорастворимых антиге. Ю, 1704087 А1 больного по реакции гиперчувствительности замедленного типа с помощью водно-солевого экстракта из клеток ретинобластомы. Новым в способе являются постановка теста In vitro u определение миграционной способности лейкоцитов периферической крови с использованием водорастворимых антигенных препаратов из биопсийного материала ткани ретинобластомы, содержащих полипептиды с мол.м. 50-100 кД в концентрации 100-200 мкг в мл в интервале 16-22 ч от начала реакции миграции, Способ позволяет повысить точность дооперацион ной диагностики как поздних, так и ранних стадий развития ретинобластомы у первичных больных, обнаружить развитие опухоли сетчатки другого глаза после удаления худшего глаза по поводу ретинобластомы. снизить травматичность и возл ожность осложнений. нов с мол.м. 50-100 кД, полученных из биопсийного материала ткан.1 ретинобластомы. Способ осуществляют следую.цим образом, B тесте торможения миграции лейкоцитов определяют миграционну о способность лейкоцитов периферической крови в присутствии антигенного препеоата из ткани ретинобластомы. Рассчитывают индекс миграции лейкоцитов (ИМ) в процентах. При значениях ИМ ниже 95 g ставят диагноз ретинобластома у первичных нелеченых больных. При значениях ИЫ равных и выше 95, ставят диагноз неопу1704087 холевая патология (у первичных нелеченых больных). Антигенный препарат для диагностики получают следующим способом. Ткань ретинобластомы, полученную в результате энуклеации и хранящуюся при20 С, раэмораживают, взвешивают и гомогениэируют на льду в физиологическом растворе хлористого натрия при рН 4,5-5,0 в весовом соотношении ткань:раствор 1;9. Гомогенат фильтруют через капроновую се ку. Фильтрат охлаждают до 2-3 С, определяют объем и при рН 4,5-5,0 добавляют хлористый калий, постоянно перемешивая, до конечной его концентрации в фильтрате 3 М. Экстракцию проводят в течение 16 ч при условиях постоянного перемешивания на магнитной мешалке. Материал центрифугируют при 20000 об/мин 30 мин при 4 С. Из полученного супернатанта на колонке с сефадексом G-75 удаляют хлористый калий и балластные вещества с мол.м. ниже 50000 Д, не обладающие диагностической активностью. На колонку размером 4.0х15 см наносят 4-5 мл образца, элюцию проводят дистиллированной водой. Фракции свободного объема с мол.м. свыше 50000 Д объединяют и лиофилиэируют. Препарат используют в тесте миграции лейкоцитов в агаровых блоках в концентрации 100-200 мкгlмл по белку. Тест торможения миграции лейкоцитов проводят следующим способом. Готовят 3 -ный агар "Дифко" в 0,05 М трис-HCI буферном растворе, содержащем 0,9 NaCI, pH 7.3. Один объем 3 -ного агара при 50 — 55 С смешивают с двумя объемами 199 среды, содержащей 1,5 сыворотки К группы человека, и заливают в пластиковые чашки до высоты слоя агар 4 мм, После застывания агара чашки ставят в эксикатор с влажной атмосферной и 5-,-ным содержанием С02. Эксикатор выдерживают при 4 С не менее 2 ч. В агаровык блоках пробойником диаметром 3 мм вырезают лунки (три для контроля беэ антигена и по три для проб с аитигенами). Агэ;ов. е блоки дс постановки реакции хранят ао в,чажной камере с 57;-ным содержанием COq при 4 С, Венозную кровь берут s r собирки с 0,5 мл 2,7;(,-ного раствора тригонэ Г по 4-5 мл от каждого больного. После оседания эритроцитов отбирают плазму, обогащенлую лейкоцитами, центри., >гируют ее при 1200 об/мин 5 мин. Осадок лейкоцитов дважды отмывают раствором Хенксэ, не содержащим ионов кальция и магния, в том i ..жиме. Довоцят концентрацию лейко" ов до 2.5":. 10 и вносят суспенэию в ,унки по 10 мкл. Затем в контрольные лунки 55 вносят по 10 мкч раствора Хенкса, а в рабочие лунки по 10 мл раствора диагностического антигенного препарата иэ ткани ретинобластомы, содержащего 100-200 мкг белка в 1 мл раствора Хенкса. Чашки с лейкоцитами в агаровых блоках помещают в эксикатор с влажной атмосферой и 57ь-ным содержанием СО2. Эксикатор помещают в термостат при 37 С на 17 ч, После инкубации в чашки с агаром заливают 107ь-ный раствор формальдегида на 1 ч для фиксирования клеток. Формалин сливают, агар подсушивают до исчезновения влаги в лунках. затем его удаляют. Проводят оценку результатов реакции. Определяют среднюю ширину зон миграции лейкоцитов в контрольных лунках (Ig) и в лунках с антигеном (1 ), как расстояние от границы лунки до края эоны миграции. Рассчитывают индекс миграции лейкоцитов по формуле MM X 100 (,. Полученные результаты статистически обработаны, подсчитаны средние значения ИМ в следующих группах обследованных детей: группа 1 — первичные больные с ретинобластомой I-IV стадий (8 детей). ИМ-79 + 127ь, диагноз подтвержден гистологически; группа 2 — больные с рецидивом ретинобластомы на втором глазу после энуклеации худшего глаза, I-II стадии процесса (12 детей). ИМ - 89 - 27ь, диагноз подтвержден гистологически по удаленному худшему глазу: группа 3 — первичные больные до операции с клинически установленным диагнозом ретинобластомы с помощью инструментальных методов и офтальмоскопически. Н! стадии (16 детей), ИМ = Р9 + 27ь, у шести детей в дальнейшем была проверена энуклеэция и диагноз подтвержден гистологически; группа 4 — контрольная группа детей с неопухолевой патологией глаза с подозрением на ретинобластому, но при положительной динамике диагноз не подтвержден или же не подтвержден гистологически после энуклеэции больного глаза (ошибка инструментальной диагностики), среднее значение ИМ - 108 ". 7,57,, состав контрольной группы по заключительному диагнозу следующий; хорио ри те нит (2 детей), рети нит Коатса (2 детей), катаракта и фиброз стекловидного тела, врожденная патология на глазном дне, последствия перснесенного увеита (8 детей, из чих двое с ошибочным диагнозом: ретинобластома, не подтвержденным гистологически после удаления глаза); пятая группа — дети с острой формой увеита (7 человек). ИМ - 100 +. 2.57ь. По критер«к> Уилкоксгнл- /анна- Уитни значения ИМ вЂ” 3 групп отл чаются от тактовых в 4 и 5 группах в,- сокам уровнем достовернос .и. Р ни1 0,.1". . Один из 36 больных 1-3 групп!2,8%) имел ИМ - 96,(,, т.е. HB уровне верхней границы д«агностически значимого показателя. Один иэ 23-х контрольных детей (4 ) имел ИМ = 95 нижний предел для контрольной группы. У двух из 23-х контрольных детей (ИМ = 100";ь, ИМ = 1057ь, 9 больных) произведена знуклеация на основании данных компьютерной томографии, гистологически ретинобластома не подтвердилась. П р им е р1. Больная С.Л., 1980 г. рожд. (обследована в 1982 г.). Диагноз — двухсторонняя ретинобластома I-II стадии, ОДМ И0Т, OS-М4айоТ. У отца ребенка— двухсторонняя ретинобластома. в детстве удалены оба глаза. У матери— врожденная катаракта. В возрасте двух лет у ребенка было замечено свечение зрачка левого глаза (OS). При поступлении в клинику передний отрезок правого глаза (ОД) не изменен, в нижнем отделе глазного дна от 5 до 7 ч ткань новообразования беловато-сероватого цвета с незначительной проминенцией в стекловидное тело, периферическая граница не офтальмоскопируется, Левый глаз — вся полость глазного яблока заполнена новообраэованной тканью. По данным ультразвукового обследования нельзя исключить ретинобластому двухстороннюю. 07.08.82 г. проведено обследование предлагаемым способом в тесте м«грац«и лейкоцитов. с использованием антигенного препарата из ткани ретинобластомы. У больной взято 5 мл ьеноэной Kp05«в проб 1pi yс 0,5мл 2.7 ного трилона Р. р"., 7.3. Vp" вь отстаивают 40 мин, после оседания эритсоцитов отбирают плазму, центр«фуг«руют ее при 1200 об/мин в течен«е 5 м«н cñ:à„ex клеток ресуспендиру от в рас-;воре Хенкса беэ кальция и магния рН 7,3, дважды переосаждают в том же режиме центрифуг«рования. Осадок клеток ресуспеч:,«, ст в 2 к л раствсра Хенкса v, с помощью камеры Горяева подсчитывают концентрац. v3 «общее количество выделенных лейксц«тое — 7,5х10 Суспенэ«ю центрифугируют в тг. л we режиме. осадок клеток рес;спенд«руюг в 0.3 мл раствора Хенкса для получения концентрации 2,5х10 . В лунки заранее приготов7 ленных агаровых г лг ов с 1 " -ным содержанием агарг "Д«. iii" «1=/-ной сыо вороткой )Ч группы «рог;и человек в 19 среде вносят по 10 мл суспенз«и. т.е. 2,5xl0 клеток на одну лунку B тр«контрольные лунки вносят по 10 мкл раствора Хенкса. а в тр«другие лунки той же чаш и вносят по 10 мкл раствора антигенного препарата в концентрации по белку 100 мкг/мл (в растворе Хенкса), полученного иэ ткани ретинобластомы указанным способом. Инкубацию проводят при 37 С во влажной камере с 5 ь-ным содержанием СО2 в течение 17 ч. Реакцию останавливают — в каждую чашку диаметром 3,5 см заливают по 2 мл 10, -ного раствора формальдегида и фиксируют в течение 1 ч, Формальдегид сливают, агар подсушивают и удаляют. С помощью бинокулярного микроскопа рассчитывают средние значения ширины эон миграции в контроле и с антигеном. Вычисляют ИМ лейкоцитов; ИМ = 827ь, что указывает на угнетение миграционной активности лейкоцитов, отражающее специфическую реакцию Т-лимфоцитов на антигены ретинобластомы. Диагноз: ретинобластома, в дальнейшем подтвержден гистологически после энуклеации худшего глаза. Исследование по предлагаемому способу проведено "слепым" методом. Больная относится к I группе. Пример 2. Больной Я.О., 1976 г, рожд. Диагноз при поступлении: врожденная патология обоих глаз, микрофтальм. помутнение роговиц, изменения на глазном дне, нистагм; подозрение на ретинобластому; роговица с обширными участками помутнения, единичные синехии, радужка атрофична, хрусталик мутный, стекловидное тело не офтальмоскопируется. рефлекса нет на глазном дне Данные ультразвукового исследован«я — единичные плавающие помутнения в стекловидном теле, отслойк« сетчатки нет. 20 05.82 г. прсведено обследова:ие предлагаемым методом. Все процедуры выполняют, аналог;1чно примеру 1, Определяют ИМ, который равен 114%. Миграционная активность лейкоцитов в ответ на ант«генный препарат соответствует норме. B дальнейшем по клинике отрицательной динамики не наблюдалось. Заключительный клинический диагноз: последствия перенесенного внутриутробного увеита, Больной отнесен к контрольной группе — неîпу>оле.-.ая ;то lîf«я сpT <а ки (IV группа). Пример 3. Больной Ш . На основан«и исследований методами элограф««« компьютерной томографи1« поставлен диагноз: односторонняя ретинобластома. 19.11.86 г. Проведено исследоган 1е предлагаемым способол1, "слепым методом. Все процедуры выполняют аналогично примеру 1. Определяют VIM лейкоц«тов: ИМ = 100 . На основании клинической инструментальной диагностикл1 г нла про1704087 55 иэведена энуклеация глаза с подозрением на ретинобластому, Гистологическое исследование не подтвердило диагноз: ретинобластома, результат совпал с результатом исследования, проведенного предлагаемым способом, исключающим ретинобластому. Заключительный диагноз — последствия перенесенного увеита. Больной отнесен к контрольной группе (IV группа). Пример 4. Больная Шк, На основании исследований методами эхографии и компьютерной томографии поставлен диа г ноз рети н обла сто ма, 24,02.88 г. и роведено исследование предлагаемым способом, "слепым" методом. Все процедуры выполняют аналогично примеру 1. Оценивают результат: ИМ - 115 . На основании результатов инструментальной диагностики больной удален глаз. Результат гистологического анализа совпал с результатом исследования: ретинобластома не подтверждена. Заключительный диагноз — последствия перенесенного увеита, Больная отнесена к контрольной группе (1Ч группа). Пример 5. Больная Ш.И., 1986 г,рожд. Диагноз: двухсторонняя ретинобластома 1 — ll стадии. При поступлении ОД (правый глаз) — степень проминенции 4,5 мм, площадь поражения до 507ь. OS (левый глаз)— степень проминенции 3.0 мм, площадь floражения 507(,. По данным ультразвукового обследования нельзя исключить ретинобластому. 20.04.88 г. проведено обследование предлагаемым методом в тесте миграции лейкоцитов с использованием антигенного препарата иэ ткани ретинобластомы. Все процедуры выполняют аналогично примеру 1, за исключением того. что концентрацию лейкоцитов доводят до 5,0 х 10 и лейкоциты 7 вносят в дозе 5,0х10 на лунку, а концентрация антигенного препарата ретинобластомы 200 мкг в мл. ИМ равен 90- .-Повторное иммунологическое обследование проведено 12.10.88 г. ИМ 85ь. Третье и лмунологическое тестирование проведено 23.11.88 г.. ИМ 82,5ь. Проведено обследование перед операцией: на худшем глазу (ОД) степень проминенции 9,0 мм, площадь поражения 80-90 . Результат иммунологического тестирования; ИМ = 85-89% Больной Ш. был удален правый глаз, Гистологическое исследование подтвердило диагноз: ретинобластома. Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность досперзционно диагностики ранних (I-II) и поздних (111IV) стадий развития ретинобластомы у 35 первичных нелеченых больных, обнаружить развитие опухоли на втором глазу после удаления худшего глаза по поводу ретинобг,ýñòoìû. Способ отличается высокой специфичностью, так как основан на специфической реакции Т-лимфоцитов к антигенам ретинобластомы, специфичность реакции показана в известном способе при использовании кожного теста. Способ не требует до рогостоя щей ап паратуры, отличается простотой, высокой воспроиэводимостью. Для оценки специфичности антигенных препаратов, получаемых из ткани ретинобластомы, были обследованы предлагаемым способом дети той же возрастной категории с лимфопролиферативными заболеваниями: злокачественными — лимфогранулематоз, лимфолейкоэ, миелолейкоэ, лимфосаркома, а также с доброкачественны ли лимфопролиферациями — лимфадениты, тонэилит — и практически здоровые дети. В обследованных контрольных группах индивидуальные значения ИМ были в пределах или выше 100;(, (ошибка оценки ИМ 2-47ь). Значения ИМ в контрольных группах, как индивидуальные, так и средние, достоверно отличаются от таковых в группе детей с ретинобластомой (Р ниже 0,001) по критерию Уилкоксона-Манна-Уитни. Данные подтверждают - высокую специфичность антигенных препаратов ретинобластомы, применяемых для диагностики предлагаемым способом. Формула изобретения Способ диагностики ретиноблэстомы у детей путем клинического исследовэния и постановки иммунологической реакции на антигснные препараты ретинобластомы, с т и и ч а ю шийся тем, что, с целью уг1рощения способа, снижения осложнений и повышения точности путем дифф еренциальной диагностики ретинобластомы от неопухолевой патологии глаза. в качестве иммунологической реакции проводят у пе в..1 »ых больных определение миграционной способности лейкоцитов периферической крови в присутствии антигенных препаратов в виде водорастворимых полипептидов. из опухолевой ткани ретинобластомы с мол.м, 50-100 кД в концент 7 ации 100-200 мкг 1 мл по белку на 2.5х10 лейкоцитов, при этом индекс миграци» рассч»- -. вают через 17 ч от начала постановки реакции и при его значении ниже 95 диагностируют ретинобластому, а при значении, равном и выше 95ф, — неопухолевую патологию глаза.
