Способ определения супероксиддисмутазной активности в крови

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения активности супероксиддисмутазы в хрови. Цель изобретения - повышение чувствительности и точности измерения активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) в крови человека. Для этого из крови пациентов получают экстракты/содержащие СОД. Измеряют люцигенин-зависимую хемилюминесценцию, отражающую интенсивность образования супероксидных радикалов при аутоокислении кверцетина, и ингибирование этого свечения СОД-содержащими экстрактами крови. По калибровочному графику, построенному для коммерческих препаратов фермента, определяют содержание СОД в исследуемых образцах крови. 1 табл. водно-спиртовая содержит супероксиддисмутазу (СОД): интерфаза в виде тонкой пленки темно-красного цвета включает гемоглобин и нижняя - прозрачная, хлороформная , СОД на содержит. Осторожно отбирают верхнюю часть еупернатанта и переносят в отдельную пробирку, разводят в 50 раз 20 мМ фосфатном буфером (рН 7,8) и в дальнейшем используют для анализа. Отдельно приготавливают стандартные растворы коммерческой СОД (Beringher) с исходными концентрациями 800, 400. 200, 100. 50, 25 и 12,5 нг/мл. II. Проведение ХЛ-анализа. В кювету для измерения ХЛ добавляют 700 мкл среды, содержащей 20 мМ фосфатный буфер (NaH Р04-КН2Р04 100 мкМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na), 40-60 мкм люцигенина (Sigma), рН 9,6. Регистрация ХЛ производилась на люминометре 1KB 1251 (Швеция) в непрерывном режиме при температуре 27°С и постоянном перемещении содержимого кюветы. В течение 2 мил Ё О 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N ЗЗ/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4769913/14 (22) 13.12.89 (46) 07,02.92. Бюл. М 5 (71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова и Научно-производственное объединение

"Витамины" (72) 3, П. Черемисина, Л, Г, Коркина, И. Б. Афанасьев и Б. Т. Величковский (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

NÜ 1521773, кл. G 01 N 33/16, 1987, (54) СПОСОБ ОПPЕДЕЛЕНИЯ СУПEPOKСИДДИСМУТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В КРОВИ

Изобретение относится к разделу клинической биохимии и может быть использовано в отделениях больниц и НИИ при обследовании больных для направленного подбора химиотерапевтических средств и контроля эа эффективностью проводимого лечения.

Цель изобретения — повышение чувствительности и точности, а также ускорение способа.

Пример l. Приготовление образца крови.

Из пальца пациента отбирают 0 1 мл крови и добавляют к 0,9 мл холодной дистиллированной воды. Через 10 мин после завершения гемолиза эритроцитов в пробирку приливают 2 мл холодной экстрагирующей смеси (1 мл эталона + 1 мл хлороформа).

Содержимое пробирки интенсивно встряхивают 5 мин и центрифугируют 60 мин при

16000 g и температуре 0-4 С. После центрифугирования смеси в пробирке представляет собой 2 фазы: верхняя — прозрачная, ... Ж„1711082 А1 (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения активности супероксиддисмутазы в Крови.

Цель изобретения — повышение чувствительности и точности измерения активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) в крови человека, Для этого из крови пациентов получают экстракты, содержащие СОД.

Измеряют люцигенин-зависимую хемилюминесценцию, отражающую интенсивность образования супероксидных радикалов при аутоокислении кверцетина, и ингибирование этого свечения СОД-содержащими экстрактами крови. По калибровочному графику, построенному для коммерческих препаратов фермента, определяют содержание СОД в исследуемых образцах крови, 1 табл. водно-спиртовая содержит супеГоксиддисмутазу (СОД). интерфаза в виде тонкои пленки темно-красного цвета включает гемоглобин и нижняя — прозрачная, хлороформная, СОД на содержит. Осторожно отбирают верхнюю часть супернатанта и переносят в отдельную пробирку, разводят в

50 раз 20 мМ фосфатном буфером (рН 7,8) и в дальнейшем используют для анализа.

Отдельно приготавливают стандартные растворы коммерческой СОД (Berlngher) с исходными концентрациями 800, 400, 200, 100, 50, 25 и 12,5 нгl мл.

lI. Проведение ХЛ-анализа.

В кювету для измерения ХЛ добавляют

700 мкл среды, содержащей 20 MM фосфатный буфер(йаНРО4-KHzP04), 100 мкМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na), 40-60 мкм люцигенина (Sigma), рН 9,6. Регистрация ХЛ производилась на люминометре 1КВ 1251 (Швеция) в непрерывном режиме при температуре 27 С и постоянном перемещении содержимого кюветы. В течение 2 мин

1711082 регистрируют фоновое свечение (Sp). С по- В таблице приведены результаты исслемощью микродозатора в кювету автомати- дования, чески вводятся 10 мкл раствора кверцетина А работах разных авторов активность в концентрации 0,1 мг/мл, приготовленного СОД соотносят таким показателям крови: к на диметилсульфоксиде. В ответ на добавку 5 числу клеток, на г гемоглобина, на мл целькверцетина развивается интенсивное све- нойкровиилизритроцитов. Первыедваспочение, которое через 1 мин выходит íà по- соба представления результатов по мнению стоянный уровень, который сохраняется в большинСтва исследователей наиболее потечение 15 мин и более. Производится под- лно отражают изменения активности СОД в счет интегрального свечения за 2 мин (SA). 10 крови. B то же время необходимо учитывать, Обычно величина $А составляла 1800- что при некоторых заболеваниях (талласе200й йй мв. мии и дефиците железа B крови) значения

В первой серии опытов через 2 мин по- активности при пересчете íà r гемоглобина сле кверцетина в кювету микродозатором могут быть завышены. В таких случаях ак, добавляют по 20 мкл стандартных раство- 15 тивность СОД лучше выражать на число клеров СОД. На добавление СОД происходит ток. Учитывая эти обстоятельства, наши кое снижение интенсивности ХЛ. Под- результаты представлены в 2-х разных форсчитывают светосумму свечения за 2 мин мах. Средние значение активност Д после добавления фермента (Sp), При кон- крови здоровых доноров составили центрации СОД в кювете 10 нг/мл Sg была 20 1797+313 мкг/г гемоглобина или 11,7 равна 370 мв, что составляет 19,5 от вели- +4,0 нг/10 эритроцитов. По данным разчины Sg в отсутствии фермента. По реэуль- ных авторов активность СОД в «рови равна татам опытов с СОД сроят калибровочный 836, либо 267 мкг/г гемоглобина. график зависимости ингибирования ХЛ Таким образом, предлагается способ, от конечной концентрации фермента; 25 который позволяет определять содержание

СОД в крови людей, обладает рядом пре б =100 „х100 имуществ по сравнению с известными раS ингибирования =

5А 8Б нее:

При соблюдении всех укаэанных усло- высокой чувствительностью (для одного вий 50 ингибирование ХЛ-реакции, со- 30 измерения требуется 20 мкл капиллярной провождающей аутоокисление кварцетина крови); наименьшая определяемая конценв щелочной среде, наблюдается при конеч- трация СОД составляет 0,5 нгlмл, ной концентрации СОД, равной 2 нгlмл, высокой специфичностью (регистрируПри спектрофотометрической оценке такой ются исключительно супероксидные радиже ингибирующей зффкт СОД наблюдается 35 калы, которые являются субстратом для

Для определения содержания СОД в хорошей воспроизводимостью резулькрови человек в овека вместо фермента в измери- татов(в параллельных пробах разброс покат 0,5-1 тельную кювету люминометра автоматиче- зателей не превышает, - ); ски добавляют 20 мкл супернатанта через 40 требуются малые затраты труда и вре2 мин после кверцетина. Аналогичным обра- мени (один анализ занимает-5 мин); эом рассчитывают ингибирования ХЛ и возможностью автоматизации при маспо калибровочному графику onðåäåëÿtoò со- совых обследованиях. держание СОД в исследуемых образцах к ови. 45 Формула изобретен и я

Р эультаты анализа. еэультаты анализа. Способ определения супероксиддисмуВ крови пациента в начале анализа из- таэной активности в крови путем отбора мерялось количество эритроцитов и содер- крови, проведения гемолиэа эритроцитов, жание гемоглобина по общепринятым добавления гемолизата в среду инкубации, икам. П и расчете количества СОД в 50 содержащую кверцетин, измерения кинетиин после ю им к овиучитываетсяраэведениецельнойкро- ки окисления кверцетина с по ду щ ви на всех стадиях приготовления СОД-со- подсчетом ингибирования этой реакции в держащих супернатантов и в ходе сравнении с контролем, о тл и ч а ю щ и йс я тем, что. с целью повышения чувствиХЛ-анализа.

55 тельности и точности, а также ускорения

Предлагаемый способом было иэмере- способа, гемолиэат предварительно обрано содержание СОД в крови 9 взрослых батываютсмесью хлороформ:зтанол при содоноров в возрасте от эрасте от 26 до 44 лет и 5 отношении гемолизат:смесь1:2 пообьему, больных с гемолитическими анемиями, центрифугируют, отделяют водно-спирто1711082

Составитель А. Агуреев

ТехРед М.МоРгентал КоРРектоР H. Король

Редактор Е. Савина

Заказ 336 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 вую фазу и добавляют ее в среду инкубации, которая дополнительно содержит люцигенин, измеряют кинетику окисления по хемилюминесценции с последующим расчетом

;ь ингибирования свечения по калибровочной кривой.