Способ получения диагностикума для выявления антител к вич

 

Изобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных аутоиммунных заболеваний. Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности определения. Для этого полистирол активируют 0.1-0,01 %-ным водным раствором глутарового альдегида в течение 20-30 мин при 37°С, затем к активированному полистиролу присоединяют альдоенолдекстран в концентрации 1-4 мкг/мл при рН 7,5-8,5 и 37°С в течение 3 ч и осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1-4 мкг/мл с альдоенолдекстраном при рН 7,5-8,5, 40-60°С в течение 20-24 ч, 2 табл.(/) С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЪСТВУ (21) 4740766/13 (22) 25.09.89 (46) 15,02.92, Бюл. N 6 (71) Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова (72) С.Н.Дробченко, В.А.Носкин, Ф.С.Нос-. ков, О.В.Носкова и Т.С.Разоренова

- (53) 576.8.093(088.8) (56) Апа1.В!оспеп ., 1980, 105, р.37!г382;

Тест-система иммуноферментная для определения антител к вирусу иммунодефицита человека "Эпитоп". Регламент производства М 138 — 88. Утверждена директором

Ленинградского НИИ эпидемиологии и мик- . робиологии им. Пастера Т.В.Перадзе

15.11.88.

Изобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных и аутоиммунных заболеваний.

Известен способ иммобилизации пептидов на планшетах для микротитрования, Способ заключается в том, что на поверхности пластика адсорбируют белки. Время сорбции составляет 12-24 ч. Количество белка составляет 100 — 200 нг на лунку.

Недостатком данного способа иммобилизации пептидов, основанного на физической сорбции, является десорбция пептидов на последующих стадиях анализа, что снижает чувствительность метода анализа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения тест-систЕмы

"Зпитон". Способ заключается в том, что. Ы, 1712362 А1 (я) s С 07 К 17/00, G 01 N 33/547 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИЧ (57) Изобретение относится к биотехнологии иммуносорбентов, используемых для диагностики инфекционных аутоиммунных заболеваний. Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности определения. Для этого полистирол активируют

0,1-0,01%-ным водным раствором глутарового альдегида в течение 20 — 30 мин при 37 С, . затем к активирован ному полистиролу присоединяют альдоенолдекстран в концентрации

1 — 4 мкг/мл при рН 7,5 — 8,5 и 37 С в течение

3 ч и осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1 — 4 мкгlмл с альдоенолдекстраном при рН 7,5 — 8,5, 40 — 600С в течение 20-24 ч, 2 табл. смесь 3 различных синтетических пептидов (соответствующих антигенным детерминантам мембранных белков ВИЧ и ВИЧ И;

H1V1 АЧЕМУ t, 41HlV 2R00, H1V1 Лз вносят в лунки полистирольных планшет и инкубируют в течение 36 ч при 37 С. После отмывки боратным буфером планшеты подсушивают. при 370С в течение 6 ч.

Однако у данного способа недостаточная чувствительность анализа антител с помощью планшет (максимальный. титр сыворотки больного не превышает 1:100, 1 200 — максимальное разделение сыворотки больного, при котором еще наблюдается цветная. реакция), вызванная десорбцией пептидов во время анализа; неравномерная сорбция пептидов полистирольной матри1712362

15 цей планшет, что снижает воспроизводимость результатов анализа антител.

Цель изобретения — повышение чувствительности и специфичности определения.

Для этого полистирол активируют 0,10,01 ) ным водным раствором глутарового альдегида в течение 20-30 мин при 37 С. К активированному полистиролу присоединяют альдоенолдекстран в концетрации 1-4 мкг/мл при рН 7,5 — 8,5, 37 С в течение 3 ч и затем осуществляют ковалентное связывание пептидов в концентрации 1-4 мкг/мл с альдоенолдекстраном при рН 7,5 — 8,5, 40-60 С в течение 20 — 24 ч.

Ковалентное присоединение пептидов к планшетам прочными химическими связями увеличивает сорбционную емкость планшет. Десорбции пептидов при последующих анализах не наблюдается, что повышает чувствительность анализа антител.

Альдоенолдекстран образует "ножку" между материалом планшет и пептидами, что делает пептиды стерически более доступными для взаимодействия антиген — антитело. Это также приводит к увеличению чувствительности выявления антител. Применение ал ьдоенолдекстрана способствует образованию монослоя пептидов на планшете.

Иммобилизация пептидов на полистирольных планшетах. В работе использованы синтетические пептиды, синтезированные в Институте биоорганической химии им.

Шемякина (Н1Ч1! АЧЕ! 1, 41Н!Ч 2 ROD, 41H1V1 Ез), соответствующие антигенным детерминантам поверхностных белков ВИЧ и ВИЧ !!, Используют планшеты для иммуноферментного анализа однократного применен ия (ТУ 64-2-375-86, производство

Ленинградского завода медицинских полимеров}.

Планшеты активируют 0,1-0,01 g,-ным водным раствором глутарового альдегида при 37 С в течение 30 мин. После отмывки от избытка альдегида боратным буфером рН 7,5-8,5 в лунки планшет вносят альдоенолдекстран с концентрацией 1 — 4 мкг в 1 мл боратного буфера. Выдерживают 3 ч при

37 С. Затем отсасывают жидкость из лунок планшет насосом и добавляют либо в смеси (1: I:1), либо в отдельности пептиды в концентрации 1 — 4 мкг на 1 мл боратного буфера рН 7,5 — 8,5. Реакцию ковалентного присоединения пептидов с альдоенолдекстраном, связаны с активированным полистиролом, проводят при 40-60 С в течение 20-24 ч, Отмывают боратным буфером с добавлением твина. Отсасывают жидкость насосом и подсушивают планшеты l,5 — 2 ч при 37 С, 20

Реакция выявления антител ВИЧ.

Постановку реакции осуществляют с сывороткой из свежей негемолизированной крови. Перед постановкой иммуноферментного анализа планшеты однократно промывают бо-. ратным буфером. Иммуноферментный анализ на планшетах, полученных по предлагаемому способу, проводят согласно инструкции по применению иммуноферментной системы для определения антител к вирусам иммунодефицита человека. Измерение оптической плотности производят спектрофотометрически при длине волны 492 нм непосредственно в планшетах на приборе MP-700 Microplate

Reader.

B табл.1 приведены данные по ковалентному связыванию пептидов по отдельности и в смеси с полистиролом предлагаемым способом. Концентрация пептида и альдоенолдекстрана 4 мкг/мл. Реакцию связывания пептидов с полистиролом проводят при рН 8, 16 при 60 С. Как видно из представленных данных пептиды как в смеси, так и в отдельности, нанесенные на планшеты, дают приблизительно одинаковую чувствительность метода анализа, несколько хуже работает планшета с пептидом H1V1

LAVE L1.

Чувствительность определения антител в результате иммобилизации пептидов.

B табл,2 представлены данные анализа антител к ВИЧ с помощью планшет, полученных предлагаемым и известным способами.

Чувствительность и специфичность определения антител.

Как видно из представленных данных при использовании планшет, полученных предлагаемым способом, чувствительность анализа антител к ВИЧ возрастает в 10-20 раз по сравнению с известным.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума для выявления антител к ВИЧ путем связывания синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам белков ВИЧ и

ВИЧ II, с полистирольной матрицей, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности определения, полистирольную матрицу предварительно активируют 0,01-0,1 -ным водным раствором глутарового альдегида при 37 С в течение 20 — 30 мин, активированную матрицу обрабатывают раствором альдоенолдекстрана с концентрацией 1 — 4 мкг/мл при рН 7,5 — 8,5 и 37 С в течение 3 ч, а связывание матрицы с пептидами осуществляют при рН

7,5-8,5 и 40-60 С путем обработки матрицы раствором пептидов с концентрацией 1-4 мкг/мл в течение 20-24 ч.

17123б2

Таблица 1

Таблица 2

Составитель H. Дробченко

Техред М.Моргентал Корректор Н. Ревская

Редактор Н. Касарда

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101Заказ 507 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5