Способ регуляции биосинтеза белка в растении

 

Изобретение относится к физиологии растений и к биохимии, в частности к способам ингибирования и стимулирования биосинтеза белка в растени. Сущность изобретения: для ингибирования биосинтеза используют раствор белка, выделенного из экскретов личинок Aphrophora costalis Mats, в концентрации 17-10 2-17. мг/мл. Для стимулирования биосинтеза берут раствор того же белка в концентрации 34-10 4- 34«10 6 мг/мл. 2 ил., 4 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 К 35/64

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 un)2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4770320/13 (22) 26,12.89 (46) 23.05.92. Бюл. N 19 (71) Казанский институт биологии (72) Н.Н,Максютова, Т:Б.Мартынова и С.И.

Панкратова (53) 581.19(088,8) (56) Г.B. Новикова с соавт. Влияние фузикокцина на синтез PHК в листьях ячменя in vivo и in vitro. Физиология растений, 1987, 34, вып, 6, с. 1121 — i127.

Патент CLUA ¹ 4672107, кл. С 07 К 15/00, 1987.

Harley R. Herschman, The role of binding

ligand in toxic hybrid proteins: А comparison

of EGF-ricin, EGF-ricin А-chain, and ricin.

Biochemical and biophysical research

communication, 1984, v. 124, ¹ 2, рр. 551—

557.

Изобретение относится к физиологии растений и к биохимии, а именно к способам регуляции биосинтеза белка в растении.

В настоящее время к вопросам регуляции различных метаболических процессов в растительных клетках, в частности синтезу белка, уделяется большое внимание. Регуляция биосинтеза осуществляется торможением или стимулированием отдельных этапов синтеза белка, поэтому важен поиск новых регуляторов.

Из научной литературы известно физиологически активное соединение интерферон человека, являющийся полипептидом и стимулирующим синтез белка в листьях пшеницы. При увеличении концентрации интерферона происходит снижение эффективности синтеза белков в растении (Влияние интерферона .человека и (2 — 5 ) „„Я2„„1734758 А1 (54) СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА

БЕЛКА В РАСТЕНИИ (57) Изобретение относится к физиологии растений и к биохимии, в частности к способам ингибирования и стимулирования биосинтеза белка в растении. Сущность изобретения: для ингибирования биосинтеза используют раствор белка, выделенного из экскретов личинок Aphrophora costalis

Mats, в концентрации 17 10 — 17 10 мг/мл, Для стимулирования биосинтеза берут раствор того же белка в концентрации 34-10—

34 10 мг/мл. 2 ил., 4 табл. олигоаденилатов на синтез белков в тканях растений. Каплан И.Б„Малышенко С.И. и (А др. ДАН СССР, 1987, т. 297, ¹ 4, стр. 1018), ф

Известен фузикокцин — токсин гриба

Fusicoccum, обладающий стимулирующим действием на синтез РНК и белка (Влияние фузикокцина на синтез PHK в листьях ячменя in vivo u in vitro..Íîâèêîâà Г.В., Д.Г.

Муромцева, Романенко Е.Г„ Селнванкнна

С;Ю„Кулаева О.Н. Физиология растений, 1987, 34, вып. 6, стр. 1121 — 1127.

Известно, что абсцизовая кислота, фитогормон, являющаяся природным ингибитором, в зависимости от физиологического состояния растения наряду с ингибированием может стимулировать синтез белка. (Влияние абсцизовой кислоты на синтез РНК и активность PHK полимераз в листьях ячменя. Романко Е.Г., Селиванкина С,Ю„Курое1734758

10

20

35

50 дов В.А„Овчаров А,К. и др. Физиология растений, 1984, 31, вып. 2, стр. 294-300.

Из патентной документации известны регуляторы биосинтеза белка, например; полипептид, полученный из специфических аллергенов и обладающий иммунодепрессантной активностью (заявка N 2134908 Великобритания (В) МКИ А 61 К 39/36, 39/35, С 07 К 7/00 "Изобретения стран мира", вы и.

60, ч, 1, № 2, 1987), низкомолекулярный полипептид, выделенный из головного мозга млекопитающих и проявляющий ингибирующее свойство на рост клеток (заявка ¹

86/04239 PCT (WO) МКИ А 61 К 37/00, С 07

К 7/00, Q 01 N 33/53 "Изобретения стран мира", вып. 15, ¹ 5, 1987), пептид, обладающий активностью ингибитора пролиновой эндопептидазы (заявка N. 61 — 183297 Япония(Р) МКИ С07 К5/08, А 61 К37/02,37!64, С 12 N 9/99 "Изобретения стран мира, вып.

60, N 1, 1988), пептид, полученный из яда или секретирующего эпителия ядовитых змей, обладающий способностью ингибировать рост клеток (пат, ¹ 4672107, США(И)

МКИ С 07 К 15/00 "Изобретения стран мира", вып. 60, ¹ 7, 1 988), Прототипом предлагаемого изобретения является рицин, белковый токсин из клещевины обыкновенной. Лектины, куда относится рицин, содержатся не только в растениях, они встречаются и в тканях беспозвоночных. У растений и беспозвоночных животных лектины, вероятно, функционируют как защитные белки, предохраняя эти лишенные иммунной системы, а следовательно, и антител организмы от вторжения паразитарных микроорганизмов, Рицин— сильно действующий яд, вызывает 50% ингибирование синтеза белка клеток А 431 при концентрации 1,4 10 М, Большинство известных в настоящее время лектинов токсично для клеток животных in vitro, но их токсичность в 1000-2000 раз ниже токсичности рицина(А, Ленинджер). Основы биохимии, М., "Мир", 1985 r., с. 348; Лектины растений; Предлагаемые функции. Марков

Е.Ю., Хавкин Э.Е. Физиология растений, т, 30, вып. 5, 1983, с, 852). Herley R, Herschman

The role of binding ligand in toxic hybrid

proteins: А comparison cf EGF-ricin, EGFricin А-chain, and rlcin, Biochemical and

biophysical research cornmunic, 1984, v. 124, N 2, с, 551 — 557.

Недостатком выбранного нами в качестве прототипа рицина в силу его токсичности является ограниченность функционал ьн ых возможностей.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей.

Цель достигается тем, что в способе регуляции биосинтеза белка в растении в качестве регулятора используют белок, выделенный из пены личинок цикады-пенницы слюнявой Aphrophora costalis Ма .з, этим регулятором ингибируют синтез белка в растении в концентрации 17 10 мгlмл—

-г

17 10 мг/мл, а стимулируют в концентрации 34 10 мг/мл — 34 10 мг/мл, Из научной литературы и патентной документации известны способы регуляции синтеза белка в растении за счет применения регуляторов различной природы. Не известны авторам (за исключением фитогормонов) регуляторы, позволяющие при одних концентрациях стимулировать роцесс биосинтеза, а при других ингибировать; Существенным отличием предлагаемого способа является использование в качестве регулятора синтеза белка растений соединения, выделенного из дешевого природного сырья — экскретов личинок цикады. При этом использование его в разной концентрации позволяет регулировать процесс биосинтеза белка растений.

На фиг. 1 показана гель-фильтрация на колонке с сефадексом-25.

На фиг. 2 показано хроматографическое разделение белка методом 8ЭЖХ

Таблица 1, Характеристика белков — пиков-экскрета, полученных ВЭЖХ.

Таблица 2. Ингибирование синтеза белков зерновок пшеницы.

Таблица 3, Регуляция биосинтеза,белка редиса, Таблица 4, Регуляция биосинтеза белка в листьях пшеницы, Способ регуляции биосинтеза белка в растении заключается в том, что в качестве регулятора биосинтеза используют белок, выделенный из экскретов цикады-пенницы слюнявой Aphrophora costalis Mats. С этой целью к пене добавляют небольшими порциями при постоянном перемешивании сульфат аммония в виде сухой соли до полного насыщения. Сформировавшийся сульфат — аммонийный осадок белка отделяют центрифугированием при 15 000 об,/мин в течение 30 минут при +4 С на центрифуге типа 317 в (Poll and). Осадок растворяют в минимальном обьеме 0,1 М Na-форфатного буфера, рН 6.8, содержащего 0,1 М NaCL

Полученный раствор обессоливают с помощью гель-фильтрации на колонке 1,6х20 см с сефадексом G-25 (Pharmacia), уравновешенной исходным буфером. На колонку наносят по 2 мл белкового раствора и ведут элюцию со скоростью 50 мл/час. По поглощения при 280 нм, регистрируемому увикордом фирмы "LKB". определяют начало

1734758 выхода белка, имеющего максимум погло-. щения в УФ-области при данной длине волны (пик 1 — фиг. 1). Фракции белка собирают по 2 мл. При появлении в элюенте сульфата, аммония (пик 2 — фиг, 1), обнаруживаемого по качественной реакции с BaClz, сбор белка прекращают. Фракции с раствором белка, свободного от сульфата аммония, объединяют и используют для дальнейшей работы (пик 1 — фиг. 1).

Обнаружено, что каллусные ткани, выращиваемые на среде с полученным белком, погибли через 20 часов после начала опыта (наблюдался полный некроз пересаженных кусочков каллусной ткани), в то время как надосадочная жидкость, содержащая все остальные соединения экскрета, не оказала влияния на прирост биомассы каллуса (102% от контроля).

Применение полученного белка приводило к ингибированию синтеза белка различных растений (таблица 3, 4), а именно, корней редиса на 60% листьев редиса на

70%, листьев пшеницы íà 62%.

Для выяснения фракционного состава белков использовалось хроматографическое разделение их методом ВЭЖХ. Было получено пять фракций с молекулярными массами от 800 кД до 1 кД (фиг, 2), Молекулярные массы белков определялись с использованием стандартных маркеров фирмы "Serva" (табл. 1). Концентрации полученных белков определялись хроматографическим методом (табл. 1), Физиологическая активность белков пиков исследовалась на зерновках пшеницы.

Пример 1. Зерновки пшеницы в фазе молочной спелости помещали в чашки Петри. В каждую чашку заливали по 5 мл раствора белков каждого пика и добавляли 50 мл раствора С-лейцина с радиоактивно14 стью 33 яСи/мл. В растворе зерновки находились 1 ч, затем их отмывали несколько раз дистиллированной водой и фиксировали жидким азотом, Образцы лиофильно высушивали. Растворимые белки выделяли из растительного материала (навеска 20 мг) последовательной экстракцией 2% KCI, 75% спиртом, 0,2% Na0H. Объем каждого растворителя был равен 2 мл. Экстракцию проводили при 4 С в течение одного часа. Белки выделяли центрифугированием в течение 15 мин при 10 тыс, об/мин, Для полноты извлечения белков экстракцию с каждым растворителем проводили 4 — 5 раз, В надосадочной жидкости определяли содержание белка по методу Лоури-Фолина и включение С-лейцина в белки на жидкост14 ном сцинтилляционном счетчике Дельта300 (США).

Как видно из данных табл. 1, белки 4 пиков (2 — 5) проявляли физиологическую активность, а именно, ингибировали включение " С-лейцина в белки зерновок, в то

5 время как белок 1 пика не оказывал влияния на синтез растворимых белков.

Пример 2. Действие полученного регулятора синтеза белка проверяли на листьях и корнях редиса. Для этого двух и

10 трех-дневные проростки редиса помещали в чашки Петри на предварительно смоченную фильтровальную бумагу, B каждую чашку Петри раскладывали по 40 растений и заливали 10 мл белка. B растворе белка рас15 тения находились в течение двух часов, затем их отмывали холодной дистиллированной водой. В пробирки с растениями добавляли по 2 мл раствора С -Д, 14

L-лейцина и выдерживали в течение двух

20 часов, Образцы отмывались холодным раствором немеченного лейцина. Растения редиса расчленялись на листья и корни. Пробы фиксировались жидким азотом, лиофильно высушивались, растирались в порошок. Для

25 выделения белка навеску растительного материала по 40 мг растирали в 2 мл 0,1 Naфосфатного буфера, содержащего 0,1 М

NaCI,рН 6,8. Экстракцию проводили при т

+4 С в течение одного часа и затем центри30 фугировали 15 мин при 10000 об/мин. B надосадочной жидкости определяли содержание белка по Лоури и включение С-лей14 цина в него (на жидкостном сцинтилляционном счетчике Дел ьта-300, 35 США), Разведение белка в диапазоне концентраций от 17 10 мг/мл до 17 10 мг/мл

14 приводит к снижению включения С-лейцина в растворимые белки листьев и корней редиса (табл.3), Происходило ингибирова40 ние синтеза белка корней редиса от 60% до

5% и листьев от 70% до 8%. Далее 4оазбавляли белок от концентрации 34 10 мг/Mfl до 34.10 мг/мл 0,1 М Na-фосфатным буфером рН 6,8 содержащим 0,1 М NaCI. Как

45 видно из таблицы 3, у корней редиса стимулирующий эффект наблюдался при концентрации белка от 34-10 мг/мл (110% от контроля) до 34-10 мг/мл (106% от контроля) с максимумом 145% от контроля при

50 концентрации белка 34-10 5 мг/мл, у листьев редиса — при концентрации белка от 34 10 мгlмл (105% от контроля) до 34-10 мг/мл (102% от контроля) с максимумом 164% от контроля при концентрации белка 34-10 5

55 мгlмл.

Пример 3. Действие белка как регулятора синтеза белка проверяли на листьях пшеницы. Для этого листья 4-х дневных растений пшеницы помещали по 20 штук в каждую пробирку и заливали по 2 мл белка.

1734758

Таблица1

Способ регуляции биосинтеза белка в растении

Дальнейшая последовательность обработки растений проводилась, как описано в примере 2. Разведение белка в диапазоне концентраций от 17 10 мгlмл до 17.10 мг/мл приводит к снижению включения Си лейцина в растворимые белки листьев пшеницы (табл. 4). Происходило ингибирование синтеза белка листьев пшеницы от 62% до

6, Действие разбавления белка приводило к стимуляции синтеза белка листьев пшеницы от 148% до 215%, как видно из табл.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что разбавленный белок действует как стимулятор синтеза белка, причем, при уменьшении концентрации белка про-. исходит усиление стимулирующего эффекта.

Дополнительным подтверждением биологической активности белка являются данные, полученные при изучении его влияния на прирост биомассы каллуса эпикотиля сои.

Пример 4. Первичный каллус получали из отрезков стебля асептических выращенных 4-х дневных проростков эпикотиля сои сорта "Волна", Эксплантанты длиной 3 мм помещали на среду следующего состава; минеральные соли по Мурасиге-Скугу, никотиновая кислота (PP) — 0,5 мг/л, пиридоксин-HCI (Вв) — 0,5 мг/мл, тиамин — НС! (В1)—

0,1 мг/л, мезоинозит — 100 мг/л, глицин — 2 мг/л, НУК вЂ” 2 мг/л, БАП вЂ” 1 мг/л, сахароза — 30 г/л, агар — 9 г/л, рН вЂ” 5,6-5 8. Культуру выращивали в темноте при 26 С и пересаживали каждые 3 недели. Разбавленный белок наслаивали на поверхность агаризованной питательной среды (по 2 мл на 1 чашку Петри d — 90 мм), используя мембранные фильтры. В контрольные варианты наслаивали дистиллированную воду или буфер, Интенсивность роста каллуса on5 ределяли через 21 день по весу сырой массы клеток.

Следует подчеркнуть, что каллусные ткани, выращиваемые на среде с добавлением исходного белка (17.10 мг/мл), погиб10 ли через 20 часов после начала опыта (наблюдался полный некроз пересаженных кусочков каллусной ткани).

При разбавлении белка до концентрации 34 10 мг/мл наблюдался максималь15 ный привес каллусной ткани — 14,24 r на грамм внесенного каллуса, что составило

163% от контроля, П редложен н ый способ позволяет удешевить научные исследования по изучению

20 регуляции синтеза белка в растении. Кроме того, новизна регулятора биосинтеза белка в растении в предложенном способе, позволит оптимизировать рост каллусных тканей, (25 Формула изобретения

Способ регуляции биосинтеза белка в растении путем воздействия, на него пептидным соединением природного проис30 хождения, отличающийся тем, что, с целью унификации способа, используют Geлок, выделенный из пены экскретов личинок

Aphrophora costalis Mats, причем для ингибирования биосинтеза раствоу белка берут

35 в концентрации 17 10 — 17 10 мг!мл, а для стимулирования биосинтеза — B концентрации 34 10 — 34 10 мг/мл.

1734758

Способ регуляции биосинтеза белка в растении

10

Таблица2

ТаблицаЗ

Способ регуляции биосинтеэа белка в растении

1734758

Таблица4

1734758

ЗС 69 96 QO t, мжй.

Составитель Л,Столярова

Редактор И.Дербак Техред М,Моргентал Корректор М.Максимишинец

Заказ 1763 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101