Способ определения молекулярно-массового распределения лектинов и гумусовых соединений почвы

 

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам молекулярно-массового распределения биологически активных веществ, в частности пектинов и гумусовых соединений почвы. Цель изобретения - упрощение способа. Дпя этого проводят ступенчатое градиентное центрифугирование градиента плотности раствора NaCI при плотности 1,005-1,2 г/см3 и скорости центрифугирования 25000-35000 об/мин в течение 3-5 ч. 10 ил.

СОЮЗ СОВГ ТСКИК

СОЦИ А Л ИС1 ИЧ Г С К ИХ

РЕСПУБЛИК (я)э С 12 P 19/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДETEJlbCTBY (21) 4639911/13 (22) 23.12,88 (46} 23.08.92. Бюл. М 31 (71) Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного (72) С.К. Воцелко, Г.А. Иутинская, Э.А. Коваленко и И.А. Симоненко (56} Орлов Д,С. Применение метода гельхроматографии в почвоведении, мелиорации и сельском хозяйстве. — Методическое руководство, — Москва-Новочеркасск, 1979, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам определения молекулярно-массового (MMP) распределения биологически активных веществ, преимущественно-гумусо° вых соединений почвы и бактериальных лекти нов, Известно определение MMP гумусовых веществ при адсорбции на геле гуминовых кислот чернозема.

Известно также использование метода гельхроматографии для определения молекулярных параметров (молекулярной массы (MM), MMP и П) гумусовых соединений почвы (фульво-кислот, гуминовых кислот); к недостаткам следует отнести плохую сопоставимость результатов по кривым

MMP и расчитанным по ним с помощью маркеров значениям MM u MMP.

Известны способы определения молекулярной массы белков при центрифугировании в градиентах плотности различных растворов. Однако они не могут быть использованы в связи с возможностью взаи„„SU „„1756357 А 1

ЛЕКТИНОВ И ГУМУСОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

ПОЧВЫ (57) Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, а именно к способам молекулярно-массового распределения биологически активных веществ, в частности лектинов и гумусовых соединений почвы, Цель изобретения — упрощение способа. Для этого проводя г ступенчатое градиентное центрифугирование градиента плотности раствора NaCI при плотности 1.005 — 1,2 г/см и скорости центрифугирования 25000-35000 об/мин в течение 3-5 ч, 10 ил, модействия гумусовых веществ или лектинов с компонентами градиентов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения молекулярно-массовой неоднородности биологически активных веществ (микробных полисахаридов), включающий градиентное центрифугирование в комбинированном градиенте плотности солей NaCI u

СзСВЗ, взятых в соотношениях (5:1) — 1;1} (V/V) при постоянном суммарном объеме, причем плотность NaCI = 1,03-1,2 г/см и

CsCI = I,2-1,6 г/см ° обеспечиваетдиапазон э по MMP — 20 " 10э — 2 * 10 .

Недостатком способа является невозможность одновременного определения физико — химических параметров биологически активных веществ.

Целью изобретения является упрощение способа.

Для этого при разделении биологических активных ве цеств и растворов стандартов

ММ (декстринов, полиэтиленгликолей) испольэ;ется градиент плотности растворов

NaO p 1,005 — 1,2 г/см, при h = 2500035000 об!мин, Т " 4-20 С в течение 3-5 ч.

Использование в качестве градиента плотности NaCI (p 1,005-1.2 г/см ) позволяет определить MM a диапазоне 500-110000.

Метод дает возможность изучать нативные неочищенные препараты, минуя ряд этапов очйстки, и одновременно анализировать от

3 до 9 ряд этапов очистки, и одновременно анализировать от 3 до 9 проб.

Исследования ММР биологически активных веществ проведены на гумусовых соединениях из почвы и внеклеточных лектинах одного из представителей рода В.

mesenterIcus (Subtllis).

Гумусовые соединения извлекали из почвы 0,1 н. раствором пирофосфата в растворе Na0H. Исследовались образцы почвы, обогащенной; сахарозой, крахмалом и микробными полисахаридами: глюканом иэ

Rlzoblum |aponicvm шт. 16, глюкоманнаном из Xanthomonas PV. Phasioll. Содержайие органического углерода в исследуемых образцах колебалось от 11,4 до 12,4 мг/г почвы.

Образцы лектинов получали из культуральной жидкости В. presentericus (subtilis) фракционным высаливанием сернокислым аммонием при 40.и 707ь насыщении (препараты Л1 и Л2 соответственно). В качестве стандартов использовали; декстраны

6 с молекулярной массой 13,7 10, 20 10, 40 1,70 10 и110. 10; полиэтиленгликоли с ММ 600, 1500, 4000, 6ООО. В случае необходимости испольэовали сахарозу с ММ 348 и раффиноэу c MM 532.

Пример 1. Показывает неизменность гидродинамических параметров исследуемых препаратов: полисахаридов, которыми обогащали почву и лектинов в присутствии растворов солей NaCI. Гидродинамические свойства препаратов изучали в водных растворах и в растворах 0,005: 0,01 M NaCI c использованием аналитической ультрацентрифуги методом "скорости седиментации" — седиментация при и = 58000 об/мин, а диффузия при п = 4000 об/мин, 3се расчеты значений вели общепринятыми методами.

Полученные значения приведены в табл.1.

Незначительное отклонение молекулярных параметров связано с допустимыми погрешностями расчета констант седиментации, диффузии, молекулярной массы по уравнению Сведберга

Sf6W RT (1 — Qp)Dgo W где V — берут по Гольцвзрду (0,68).

Следовательно в присутствии 001 М растворов NaCI молекулярные характеристики изучаемых биологически активных веществ (гумусовых соединений почвы и

5 бактериальных лектинов) стабильны, что свидетельствует о правомерности изучения биологически активных биополимеров в условиях предло.аемого градиента плотности растворов NaCI.

10 Пример 2, Показывает ММР маркеров-декстранов с ММ 15 10, 20 . 10, 6 . 6

40 10, 70 . 10, 110, полиэтиленгликолей с ММ1,5 -10,4 . 106,6 10 иуглеводных компонентов органического вещества по15 чвы, обогащенного "биозоном" в градиенте плотности NaCI 1,005-1,2 г/см, взятых в з различных соотношениях по объему, при

n = 25-35000 об/мин в течение 3-5 ч (фиг.

1-3). На фиг.1 и 2 показано MMP маркеров.

20 Кривая MMP а (обозначенная -o-o) (фиг.2) получена при режиме n =- 35000 об/мин, t = 5 ч и захватывает интервал MM 1 5 . 10, 6

4 10,6 10,20 10, 40 10 и 70 106.

Кривая MMP в (— ) и с (..х...x) (фиг.2) получены

25 при режиме и = 30000 об/мин, t =- 4 х и дают четкий интервал разделения по ММ в интервале 13 106 — 110 ° 106.

На фиг.2 представлены следующие кривые MMP: а -(о-о-) получена в режиме

n=-30000 об/мин, т=4ч и четкий интервал в MMP отмечается в диапазоне 13 . 10 -110 10 .

Вместе с тем кривая ММР в (— ), полученная в режиме n = 20000 об/мин и t = 6 ч, не имеет четкого распределения, Кривая MMP c

35 (...х„,х...) получена при режиме и = 50000 об/мин и t = 2 ч. Необходимо отметить, что в интервале MM 40 — 110 10 информация

6 теряется вследствие того, что маркеры осаждаются на дно.

40 На фиг.3 показано распределение углеводных компонентов органического вещества почвы; обогащенного "биозоном"— гликан, Кривь.e MMP отражают режимы: а— и = 35000 об!мин, t = 5 ч., б — п = 25000

45 o6/мин, t = 3 ч, в — п = 30000 об/мин, 1 = 5 ч, с — n =50000 об/мин, t = 2 ч, при постоянном суммарном объеме градиента NaCI — V = 5 мл. Так на кривой MMP а — показана возможность расширения нижнего диапазона

50 границы. Определение MM проводится при использовании по объему раствора NaCI c более низкой плотностью, а в качестве маркеров полиэтиленгликолевой с MM (1,5 10, 6

4 10 6 106) а также декстранов MM

15 10, 20 10, 70 10 . 110 10, Кривые

ММР б, в, с показывают зависимость четкости М!1Р от p:::èìà опыта, при средневесовой ММ образца 63-58 . 10 . Только в более

6 четко дг .т представление об истинном мо 1756357 лекулярном распределении данного образца — это его оптимальный режим разделения, Следует заметить, что значительное увеличение времени или скорости центрифугирования, не дает улучшения получаемых результатов для данного градиента плотности.

Пример 3, Показывает возможность использования предлагаемого способа для анализа MMP внеклеточных лектинов в нативном неочищенном состоянии, выделенных иэ культуральной жидкости продуцента

В. rnesentericus (subtiiis) высаливанием

10 (NH2)S04 при 40 и 70 / насыщении (препараты соответственно Л1 и Л2). 15

При этом центрифугирование проводили в режиме, n = 30000 об/мин, t = 3 ч, при

Ч = 5,5 мл в ступенчатом градиенте NaCl (p> = 1,2 — 0,5 мл,рай=1,1 — 0,5мл,р э=1,05-0,5

20 мл, р 4 = 1,03 — 0,5 мл, p g = 1,02-0,5 мл, ре =- 1,01-0,5 мл и р7 = 1,005-0,5 мл на

Данные кривых MMP препаратов лектинов свидетельствуют о том, что в препарате

Л1 доминирует компонент с ММ 14-15 10 с незначительными примесями компонентов с MM 60 и 70 10; в препарате ЛИ преобладает компонент с MM 21-25 106, в этом препарате имеется незначительное количество компонентов с ММ 40 10, 70 . 10 и 110 106.

Применение предлагаемого способа позволило показать, что лектины В.

mesentericus (sub(ills) представляют собой гликопротеины с различной MM и небольшой степенью полидисперсности, при этом препаративных ультрацентрифугах:

АС=601, К-32 и БЕКМАН Л-6. В качестве маркеров использовали декстраны фирмы

"Флюка" с MM 13,5 . 10, 20 10, 40 10 25 и 110 10 . Учитывая возможности центри6 фуг в одну из пробирок помещали маркеры, а в остальные 2-5-8 — исследуемые образцы. После окончания центрифугирования образцов или маркеров во фракциях апре- 30 деляли качественное и количественное содержание углеводов (фенол-серным методом). При построении кривых ММР по оси Y откладывали интенсивность поглощения при Л = 490 нм, а по оси Х вЂ” номер 35 фракции. На фиг,4 и 5 приводятся кривые, где а — маркеры, с — образцы. Наличие в образцах белковой составляющей в молекуле лектинов определяли методом Лоури и строили аналогичные кривые MMP -фиг.4 и 40

5 в; где по оси Y отмечали количественное содержание по белку, Кривые по MMP оценивались как в качественном аспекте, так и в количественном, е препарате Л1 — содержится больше углеводных, а в ЛИ вЂ” белковых KGMIloHeHTOB, Пример 4, Показывает использование предлагаемого способа определения

MMP для изучения молекулярных параметров гумусовых соединений почвы. На примере темно-каштановой среднесуглинистой слабосолонцеватой почвы исследовалась динамика распределения углеводных компонентов по фракциям гумусовых соединений, отличающихся своими характеристиками.

Исследуемую почву обогащали различными полисахаридами, отличающимися по химическому составу: глюкан — из Rizob n

japon1cum шт. N 16 (фиг.6). Глюкоманан из

Xanthomonas рч. phasloli (фиг.7 и 8), и определяли обогащенность углеводами различных фракций гумусовых соединений а динамике 1, 2, 3 и 15 сут. Исследуемые образцы 7 — 9 получали по одной методике, При оценке процессов разложения, деструкции структурирования в данной серии опытов остановились на следующем режиме; п =30000 об/мин, ступенчатый градиент плотности NaCI созданный при р = 1,005—

1,2 г/см, pz-=1,2 — 1 мл, рз=1,1 — 1,5мл; р4 = з

1,05-1 мл; р = 1,03-1 мл; рв = 1,02-0,5 мл

V; pg = 1,005 — 0,5 мл V).

Наличие маркеров и углеводов во фракциях исследуемых почв определяли фенолсерным методом, при этом образцы изу!али как окрашенные, так и не окрашенные, результаты совпадали. Это показано на примере образцов почвы, обогащенной бактериальным глюканом из Rlzobium

japonicum шт. N. 16 (см. фиг,6 и табл.2).

Пользуясь методическим подходом Орлова расчета ММ, процента по MM при анализе кривых ММР, получены результать по кривым MMP фиг.6 — 8. Более подробно рассматриваются образцы 7 — 9 — контроль

{фиг,6, табл,2; фиг.7, табл.3; фиг,8 табл. 4).

Получен ные результаты образца

Rlzoblum)ap0nlcum шт. 16 {табл.2, фиг,6) показывают, что в процессе трансформации микробных полисахаридов, внесенных в почву, на первых этапах (фиг.6) потребление углеводов из низкомолекулярных фракций, при более глубоком разложении, кривая

MMP (фиг,6) начинается использование сахаров и средних высокомолекулярных фракций, Анализ кривых фиг.7 и 8 проводили по вышеприведенной схеме.

Г олученные данные позволили проследить, как в темно-каштановой почве происходят процессы деструкции полисахаридов, фрагментарного обновления гумусовых соединений, которые находят отражение в из1756357

Таблица 1

2о с

Препарат

rIS/В белок углероды

68000 в НО

40000 в 0,005И NaCI

30000 в И О

1,8 ° 10

4,5-10

6,o ° 10

2,0 ° 10

2,4 10

3,0 10 "

Экзополисахарид из Rizobium

j aponicum шт,16

Глюка н

Экзополисахарид из Xanthomonas

fudcans рч.

phasidi

Глюкоманнан

5,3 10 ,4,0 "10

2 8 1015

4 0 ° 10

35000 в О 01И ИаС1

80000 в П 0

78000 в 0,01И NaCI

14000 в Н 0

Иэннан

Ианнан

Препарат Л1 0,03 0,065

В.mesentericus (subti1is) (4,6:1) 1,3 ° 10

2,0-10

3,3 ° l 0

3,2 ° 10

15000 s 0,01И NaCI

Препарат Л2

В,шезепйег саз 1,4 0,358 (subtilis) (3,9:1) Зэ5 10 1э2 10 „ 21000 24000 в НзО

3,0.10 $,5-10 25000 в 0,01И NaCI

Й р и м е ч а н и е. S,Ч вЂ” константа седмиментации; з ер Ф

П,М вЂ” константа диффузии;

Концентрированный раствор - О,GI .И NaCl, соответствует плотности 1/2 r/ñì3 ° менениях: процентном соотношении тех или иных молекулярных массовых компонентов.

Пример 5. Показано соответствие результатов, полученных при использовании предлагаемого метода для анализа бактериальных лектинов и метода дискзлектрофореза в ПААГе в присутствии Ма-додецилсульфата.

На фиг. 9 и 10 показано распределение белковых компонентов с различной ММ. Так, в препарате Л1 (фиг.9) преобладает компонент с ММ в пределах 12 ° 10 — 14 ° 10 (124,1 и 106,6), а в препарате ЛИ фиг.11— компонентс MM23 " 10 — 26 10 (значения

104,5 и 101,3). В обоих препаратах лектинов имеются компоненты и с другой MM.

Формула изобретения

5 Способ определения молекулярно-массового распределения лектинов и гумусовых соединений почвы, предусматривающий фракционное разделение образцов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения

10 способа, фракционирование проводят ступенчатым градиентным центрифугированием в растворе NaCI плотностью 1,005-1,2 г/см при частоте центрифугирования

25000 — 35000 об/мин в течение 3-5 ч, 1756357

Таблица2

Средневесовые молекулярные массы - ИЧ углеводов в различных фракциях гуминовых соединений почвы, обогащенной глюканом иэ Rizobium japonicum шт. 16 (по данным обработки кривых ИМР (фиг. 7) Номер фракций

".ст

Номер фракции градиента

Препарат

° «еа в а е в

° Е»«а в а«

16 очищенный

I 25,3

35280 хх 14,1

III 44 7

IV 15,3

16„„, 76500

102 до

2 3

3,4,5,6

6,7,8,9,10,11

11,12,13

49230

1,2

2,3,4 5

52200

«1 Р - 4ОООО аав ееееееевевееваааееавеаввввеееевеввааейеевааае

1, 2

2,3;4

4,5,6,7

7,8 9,10,11

1,2

234

4,5,6

6,7,8,9,10

10,11,12,13

13,14,15

6,7,8

8 9 1О

10,11,12

12,13,14,15 а ее йо 13,7 10

20 10.

40.10

70 10

6 йэ 13 7е10

20 1 О

40 10

70 ° 10 (70-И 0/10

110 10

13070106

20" 10

40" 10

70" 1 О

11O 10

Д 13,7..106

20 10

40, ° 10

40" 70 ° 10

70 ° 10 (70-110) 10

110 ° 10

6,8

7,8 пт 10,7

1Ч 50,0

15,0

17,6

II 7,3

Ш 36,0

IV 30,6

V 8,5

I 2,0

II 15 5

III 60,0IV 1,5

2 5

V 304

1756357

Т а б л и ц а 3

Средневесовые молекулярные массы — HW углеводов в различных фракциях гумусовых соединений почвы, обогаценной глюкоманнаном Xanthoraonas fuscans pv,phasioli

Препа" Номер фракций рат градиента

Процент фракций ст

1,2

2,3

3,4,5

5,6,7.

45750 х

9,10>12

49415

Х,1

5 5 хх 7,0

13,9

11,2

12 5

V 169

74205

Хг 2

До 15 lО Х

20 10

40" 10 (40-70) 10

70 10 (70-110) 10

1 l 0.10

?2135

9,7

40,1

10 у3

NS/D - =30000 п = 1,5 l0,0

39,0

1,2

2,3,4

4,5,6,7

7,8,9

9,1О,12

11,13

1,2

2 3,4

4,5,6,7

7,Å.9

9,10,11,12,13

13,14,15

1,2

2,3,4

4,5,6,7, 7,8,9

9 10,11

11,12,13

13 14 15,16

До 15 ° 10

20 10

40 10

| 4О-7%1 06

70 10

I1О"10

До 15 ° 10

20" 1 О

40 10

40-70 10

6 (70-110) 10

110 10

До 15 10

20 ° 10

40" 10 (40-70) 10 (70-и o) 10

110 10

Х 15,0

Ц 13,7 тП 42,1

Щ 699

8,7

V 137 т б 5

II 32,3

11 6 l1,5

IV 24,4

14,2

1756357

Таблица

Средневесовые молекулярные массы - 351 углеводов в различных фракциях гумусовых соединений почвы - контроль (полученные по данным обработки кривых В1Р (Фиг.7) Препа- Номер фракций И „ 4 фракций рат град.

1,2

2,3

3,4,5,6

6,7,8,9,10 11 2

-2712 54010

31,4

13,6

11 12,3

1,2

2,3

3,4,5,6

6,7,8,9

9 10,11

11,12,13,14

112

2 3

3,4,5,6

6,7,8,9,10

11,12 иг s %l

До 13,7 ° 10 I

20 10 II б

40 10 III

70 10 IV

110 106 Ч

До 13,7110 I

20 10 II

40 10 III

70"10 Чт

70-11 0

110 10

1,2 До 13,7 10

2,3 20 10 II

3,4,5,6 40 10 Ш

6,7,8,9,10,11 70 10 IV

11,12,13,14 110 10 V

До 13,7..104

20 ° 10

40 10

70 ° 10

110 10

9,3

9,2

10,7 58113

41,1

16,1

13,1

9,О

9,0 72630

30,3

40,4

12,0

39„1 48680

33,6

5,2

1756357

02

or

Фи Я

1756357

1756357

1756357 f756357

ЮГ МР

175б357 нг

Pf Jl б. 15

Ю Фартам>

0.3

0,2

ОО

0,0

0,О

1 2 Л 4 5 8 7 8 У ЮО 18 ОЖ/ЯФ Л Мрраюцид

Фиг 8

Составитель С,Воцелко

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор С.Патрушева

Редактор Н.Рогулич

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул Гагарина, 101

Заказ 3062 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5