Штамм бактерий соrynевастеriuм sереdоniсuм - продуцент полисахарида, индуцирующего образование интерферона

 

Использование: полисахарид может быть использован в профилактике и лечении опухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состояний. Сущность изобретения: Штамм Corynebacterlum sepedonicum ВНИИА 1857 является продуцентом полисахарида, индуцирующего образование интерферона с высокой активностью. Штамм Corynebacterlum sepedonicum выделен из клубней картофеля . При росте на жидкой синтетической среде , в которой в качестве источника азота используется хлористый аммоний, а углерода - глюкоза (стоимость 1 л среды составляет 16 коп), клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование интерферона лейкоцитами периферической крови человека , а также культурами мышиных фибробластов. Полисахарид состоит из следующих моносахаридов: рамнозы и галактозы. Кислая природа полисахарида обусловлена присутствием пировИноградной кислоты. 2 ил. 1 табл.

СОЗОЗ CO (3L= ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

» SU 1756349 А1 (st)s С 12 и 1/20, С 12 Р 19/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

3N

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ «333 - íàíùí

@сП РИОТЕНА

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ используется хлористый аммоний, а углерода — глюкоза (стоимость 1 л среды составляет 16 коп), клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование интерферона

1 лейкоцитами периферической крови человека, а также культурами мышиных фибробластов. Полисахарид сос.гоит из следующих моносахаридов: рамнозы и галактозы. Кислая природа полисахарида обусловлена присутствием пировиноградной кислоты. 2 ил. 1 табл, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ GORYNEBACTERIUM

SE P E DON I CUM — ПРОДУЦЕ НТ ПОЛ И САХАРИДА, ИНДУЦИРУЮЩЕГО .ОБРАЗОВАНИЕ ИНТЕРФЕРОНА (57) Использование: полисахарид может быть использован в профилактике и лечении (21) 4817938/13 (22) 23.03.90 (46) 23.08.92. Бюл. М 31 (71) Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного, Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. П,В. Громашевского (72) Л.Д. Варбанец, P.È. Гвоздяк, В.А. Мурас, IH.ß, Спивак, А.Ф. Фролов, С.Л. Рыбалко, С.Т. Дядюн, И.Н. Гавриш, В.А. Дьяченко и И.я. Захарова (56) Ермольева З.В., Вайсберг Г.Е. Стимуляция неспецифической резистентности организма и бактериальные полисахариды. — M.:

Медицина, 1976, с. 187.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности для получения иммуномодуляторов, в частности полисахаридов. обладающих способностью индуцйровать образование интерферона в клетках человека и животных, Известен продуцент полисахарида

Bacterium prodlgiosum, получившего назваwe продигиоэан, который проявляет интерферониндуцирующее действие.

Выращивание указанного продуцента проводится на среде„содержащей дорогостоящие реактивы — мясо-пептонный бульопухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состояний. Сущность изобретения: Штамм Соrynebacterlum

sepedonlcum ВНИИА 1857 является продуцентом полисахарида. индуцирующего образование интерферона с высокой активностью, Штамм Corynebacterlum

sepedonlcum выделен из клубней картофеля. При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота он, мясо-пептонный агар. Стоимость 1 л среды для выращивания В. prodiglosum составляет 2 руб, Для получения продигиозона густой смыв культуры В. prodlgiosum штамм К обрабатывают многократно 0,5 M раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) при 4 С.

Объединенные экстракты тщательно освобождают от взвешенных частиц на центрифуге при 10-12 тыс, об/мин и осаждают на холоду шестью объемами охлажденного этанола с добавлением насыщенного спиртового раствора уксуснокисвого натрия из расчета 33 мл/л, После полного выпадения осадок отдекляют на центрифуге и подвер1756349 гают диализу в течение 3-сут в проточной водопроводной воде и 24 ч в дистиллированной воде, После диализа препарат подвергают лиофильной сушке. В нем обнаружены следующие моносахариды; глюкоза, галактоза, манноза. глюкозамин.

Продигиозан является токсичным, максимально переносимая доза в опытах на белых мышах составляла 0,125-5,0 мг/кг, ЛД о равнялась 2-2,5 мг/кг, активность 16-64 ед.

Недостатками известного продуцента являются: выращивание продуцента осуществляется на дорогостоящих средах; низкая активность продигиозана; токсичность продигиозана.

Целью изобретения является получение нового штамма — продуцента полисахарида, проявляющего активность индуктора интерферона.

Новый штамм С. sepedonicum ИМВ

7694, обладающий указанными выше свойствами, выделен из больных клубней картофеля, Для этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезают стерильным скальпелем, промывают в течение 15-20 мин несколькими порциями стерильной воды. Затем растительную ткань растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюся гомогенную кашицу высевают петлей на поверхность агара на чашках Петри. Чашки помещают в термастат (температура 25 3) С. Питательными средами для выделения бактерий обычно служат: картофельный агар; картофельный агар+ 17; дрожжевого автолизата; агар картофельный + 1 глюкозы; мясопептонный агар.

Культуру хранят: а/в пробирках на косяках с картофельным агаром при комнатной температуре, б/в пробирках на косяках с картофельным агаром, поверхность которого заливают растительным маслом.

Состав среды картофельный агар. на 1 л дистиллированной воды 200 г картофеля.

0,57 хлористого натрия, 1,5-2,0 агара, рН 7,0-7.2, Штамм С. sepedonicum ИМ В 7694 депонирован в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков Минмедпрома и имеет регистрационный номер 1857.

Штамм С. sepedonicvm ВНИИА 1857 имеет следующие морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические свойства — хорошо растет на обычных питательных средах.

На картофельном агаре — колонии кру лые, гладкие, приподнятые, блестящие, сл» бо слизистые, желто-оранжевые, На мясо-пептонном агаре — колонии круглые, гладкие, более прозрачные, чем при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистенции.

При росте в мясо-пептонном бульоне— культура растет умеренно, образует нежную пленку и небольшой осадок.

Культура растет в аэробных условиях, оптимальня температура роста (25 + 3) С, минимальная 3-4 С, максимальная 305

15 31 С. рН; оптимальное 7,0 + 0,2; растут в интервале рН от 6,7 до 7,4.

Физиолого-биохимические и ризнаки.

Культура не образует кислоту из глюкозы, мальтозы, мелецитозы, инулина, лактозы, сахарозы, маннита, салицина, дульцита, сорбита; Не образует сероводород, индол, нитраты не редуцирует, молоко слабо пептонизирует, не разжижает желатины, Использует ацетат, сукцинат, не использует лактат и пропионат, Факторы роста — биотин, никотиновая кислота, гистидин, пурин, пиримидин, метионин, аспарагин. Цистеин и другие аминокислоты могут ингиби ровать рост бактерий, Штамм С. sepedonicum ИМВ 7694 при

30 культивировании на жидкой синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а азота — хлористый аммоний, сйнтезирует полисахарид, обла35 дающий способностью индуцировать образование интерферона в клетках человека и животных.

Безвредность, Штамм С. sepedonicum

ИМВ 7694 не вирулентен, не токсичен для

40 теплокровных животных, Введение 24-часовой культуры С, sepedonicum ИМВ 7694 внутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на

1 мышь, а также фильтратов среды роста

45 (после культивирования культуры на жидкой синтетической среде) не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов

50 животных.

Штамм 7694 С. sepedonicum не патогенен для теплокровных животных.

Выращиавние бактериальной массы С.

sepedonicum ИМВ 7694 и получение пол55 исахарида осуществляли следующим образом, Для получения.инокулята используют

24-часовую культуру, выращенную на картофельном агаре при(25 3) C. Выращивание продуцента осуществляют в колбах обье 1756349 мом 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава. г/л: MgS04 0,2; NagHPOn 6,0, КН2Р04 3,0;

NHqCi 1,0; глюкоза 5,0.

Выращивание культуры продуцента осуществляют при (25 "- 3) С в течение

35-41 ч, целевой продукт выделяют мягким щелочным гидролизом целых клеток.

П р е м е р 1. Культуру С. sepedonicum

MM8 7694, хранящуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при (25 - 3) C в течение 24 ч, Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного выше состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл аналогичной питательной среды; выращивают на качалках (240 06/мин) в течение 31 ч.

Клетки осаждают центрифугированием при

5000 об/мин в течение 20 — 25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5 j,-ном растворе КОН (100 мл на 10 r влажных клеток) в течение 1,5-2,0 ч. Гицролизат диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5000 об/мин в течение 20 — 25 мин, Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок полисахарида освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЗАЭ-ТСК геле. Полисахарид, целевой продукт, элюируют 0,50 М раствором ИаН РО, рН 6,0.

Фракции полисахарида собирают, диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лиофильно высушивают, Гомогенность полисахарида показана гель-фильтрацией на сефарозе 6В (фиг.1), В целевом продукте содер>кится 80 и 57, углеводоров.

Моносахаридный состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг,2), а также С-ЯМР спектроскопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повторяющих звеньев, представленных остатками рамнозы (двумя) и остатками галактозы (двумя), к С4 и С6 которой присоединяется пировиноградная кислота, Молекулярная масса полисахарида, установленная методами гельхроматографии на сефарозе 6В, а также седиментации и диффузии, составляет 60 000.

Выход очищенного полисахарида составляет 4-5 Д сухой массы клеток.

Полученный полисахарид проверяют на интерферониндуцирующую активность, 5 Индукцию интерферона в опытах in

vi.ro проводили внесением в суспензию лейкоцитов периферической крови человека (5 10 клеток/мл) полисахарида в конеч6 ной концентрации 200 мкг) в пробе. Смесь

10 инкубируют при 37 С в течение 24 ч, затем центрифугируют, В опытах1п vivo животным (мыши линии СВА с массой 18-20 г) внутрибрюшинно вводят полисахарид в дозе 10 и

100 мкг/мышь в 0,5 мл. Через 4 и 24 ч после

15 введения полисахарида мышь декапитируют и собирают пул сывороток, получают . спленоциты общепринятым методом путем разволокнения ткани селезенки. Ложный сывороточный интерферон получают, вво20 дя животным вместо полисахарида аллантоисную жидкость. В полученном материале (сыворотки, суспензии спленоцитов, культуральная среда) определяют активность интерферона по способности подавлять

25 цитотоксическое действие вируса-индикатора (вирус везикулярного стоматита—

BBC), 100 тканевых цитопатогенных доз (ТЦД)мл. Учет результатов проводили через

48 ч. Зэ единицу активности принимают ве30 личины, обратные максимальному разведению интерферона, предотвращающему нэ

507, цитопатическое действие 100 ТЦД ВВС в культуре перевиваемых человеческих лейкоцитов линии L4< или культурами мышиных

35 фибробластов линии Lgzg соответственно, Тип интерферона определяют по ингибированию активности интерферона специфическими моноклональными антителами к препаратам у — и а-типам человеческого

40 интерферона.

В опытах in vitro интерферониндуцирующая активность полисахарида составила

1920 + 580 И Е о/мл.

При изучении интерфероногенной ак45 тив::ости в опытах in vivo было установлено, что внутрибрюшинное введение его в дозе

0,5 — 5,0 мг/мг спустя 4 ч вызывает образование интерферона в селезенках и сыворотках крови мышей, При этом оказалось, что вве50 дение полисахарида в дозе 0,5 мг/кг вызывало продукцию интерферона гораздо более эффективнее по сравнению с другими исследованными дозами.

При сравнительном изучении интер55 фероногенной активности известных препаратов продигиозана установлено, что предлагаемый полисахарид более эффективен (табл.).

1756349

Предлагаемый полисахарид не является токсичным даже в дозе 40 мг/кг (ЛДgp продигиозана равна 2-3,5 мг/кг)., не обладает побочными эффектами, Продигиозан вызывает повышение температуры тела примерно у 30 больных через 2-4 ч после иньекции до субфебриальных цифр, Таким образом, предлагаемый нами штамм 7694 С, sepedonicum является новым штаммом, продуцирующим полисахарид, являющийся активным индуктором у-интерферона.

Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивания B.

prodiglosum.

Полисахарид в отличие от продигиозана является токсичным и не обладает побочными действиями.

Изобретение может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, при этом не требуется дополнительных ассигнований для осуще5 ствления технологических процессов выращивания продуцента и выделения из него полисахарида.

Интерфероногенная активность полисахарида Corynebacterium sepedonicum

10 ИМВ 7694 и продигиозана Bacterium ргоб!доозив приведена в таблице.

Формула изобретения

15 Штамм бактерий Corynebacterlum

sepedonicum BHHMA 1857 — продуцеит полисахарида, индуцирующего образование интерферона, 1756349

Составитель Л.Варбанец

Текред M.Mîðleí÷àë Корректор Н.Гунько

Редактор Н.Рогулич йроиаводственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 3662 TNp8)K Подписное

ВНИИПИ Государственно о комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР, 113635, Москва, X-35, Раушская наб., 4/5