Способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований

 

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинической диагностике . Целью изобретения является ускорение и улучшение качества целевого продукта. Сущность изобретения заключается о обработке поверхности стекла годным раствором аминирующего агента, его эксплуатации и последующим нанесении на него взвеси эритроцитов, последующей инкубации и отмывки, причем в качестве амппирующего агента используют 2,5%-ныи растоор у-аминопропилтриэтоксисилзна, экспозицию осуществляют при температуре 100°С в течение 15 мин, а инкубацию .эритроцитов в течение 5-10 мин. Положитепьный эффект заключается в ускорении процесса в 4,5 раза с сохранением 09% жизнеспособных клеток. i I- т

COl0:.3 СОВГ- ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ6Лик

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕГ! ЬСТВУ (21) 4837622/14 (22) 11.06.90 (46) 23.08.92. Бюл, М 31 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) И,Н.Большаков, A.Б.Рабовский и

С.М.Насибов (56) Иммунология, 1980, М 5, с. 80-81. (54) СПОСОБ:. ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЛ

ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (57) Использование: изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинической диагностике. Целью изобретения является Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, Наиболее близким техническим решением, к изобретению является способ использования 2,5-ионена-донатора аминогрупп для аминирования стекла.

На обезжиренную стеклянную поверхность чашек типа "Орион" наносят 2,5,4ный водный раствор 2,5-ионена с ФЗФ (рН

7,4) в количестве 4 мл на o„íó чашку, Э кспозиция с целью электростатического. прикрепления поликатиона к стеклу составляет

2 ч при комнатной температуре. После экспозиции поликатион сливают, чашки отмывают ФЗФ без поликатиона и наносят на них 4 jp-ную взвесь отмытых эритроцитов в ФЗФ; Экспозиция прикрепления эритроцитоп составляет 45 мин при комнатной температуре, После экспозиции зритроцитарной взвеси чашки тщательно отмывают.5U; 1756822 А1 ускорение и улучшение качества целевого продукта. Сущность изобретения заключается в обработке поверхности стекла водным раствором аминирующего агента, его эксплуатации и последующим нанесении на него взвеси эритроцитоп, последу1ощей инкубации и отмывки, причем в качестве амннирующего агента используют 2,5 j--ный раствор "-аминопропилтриэтоксисиланв, экспозицию осуществляют при температуре

100 С в течение 15 мин, а инкубаци,о эритроцитов — и течение 5-10 мин. Положительный эффект заключается в ускорении процесса в 4,5 раза с сохранением 09 g . жизнеспособных клеток. для удаления неадгезированных эритроцитов, Полученный монослой используют оогласно поставленной цели. Время полу гения монослоя cocTGGëëåò 3 ч. Прикрепление эритроцитов к стеклу происхолит Рсл дствие того, что суммарный заряд стекла является отрицательным, поликатион заряжен положительно, поверхность эритроцита суммарно заряжена отрицательно.

Однако в известном способе получен!»" монослоя эритроцитов имеются существенные недостатки..Прикрепление эритроцитов к поверхности стекла недостато.гно прочно, поскольку нанесение на поверхнос ь стекла 2,5-ионена предполагает oGpàзованис двух слоев электростатических связей: пе вый слой — отрицательно заряженные группировки стекла и положительно заря>:ен.-! le группы,Ь-ионенэ, второи слои

1756822 — отрицательно заряженные группировки эритроцитов и положительно заряженные группы 2,5-ионена. Два слоя зарядов не обеспечивают прочность фиксации клетки к стеклу, поэтому для сохранения целостности монослоя требуется особая осторожность при отмывании его от эритроцитов буфером, особая осторожность при наслоении лимфоцитов на монослой и отмывание от непрекрепившихся лимфоцитов, Несмотря на это, добиться образования сплошного монослоя на 100% поверхности стекла все же не удается. Все это создает трудности работы с монаслоем, увеличивает материальные и временные затраты на получение монослоя, превышающие обычные для этого метода 3 ч. В итоге трудоемкость получения монослоя велика. Кроме того, стоимость препарата достаточно высока — для обработки одной чашки требуется реактив стоимостью около 25 долларов, Цель изобретения — ускорение и улучшение качества целевого продукта.

Указанная цель достигается использованием в качестве донатора аминогрупп для получения положительно заряженной поверхности стекла ) -аминопропилтриэтоксисилана.

Способ осуществляется следующим образом.

На тщательно обезжиренную стеклянную поверхность чашки Петри наносят 5-10 мл 2,5%-ного водного раствора у-аминопропилтриэтоксисилана. Чашку помещают в суховоздушный шкаф при 100 С на 15 мин.

После прогревания раствору-аминопропилтриэтоксисилана сливают и он может быть использован многократно. Чашку промывают тщательно дистиллированной водой и два раза ФЗФ (рН 7,2-7,4), На подготовленную таким образом стеклянную поверхность наносят 4%-ную взвесь отмытых эритроцитов любого животного или человека, Объем эритроцитарной взвеси составляет 4-10 мл.

Экспозиция для связывания эритроцитов составляет 5 мин. Неадгезированные эритроциты тщательно отмывают ФЗФ (рН

7,4). Полученный монослой эритроцитов готов к использованию в зависимости от поставленной цели. Время получения монослоя предлагаемым способом составляет

35-40 мин, Качество получаемого монослоя определяется под микроскопом при увеличении объектива в 200 раз(отмечается наличие свободно плавающих в растворе эритроцитов, непрерывность монослоя в полях зрения, Качество монослоя отмечается знаками; с т о к л . о э

P т р о ц и т

С целью отработки оптимальных режи45 мов для получения эритроцитарного монослоя от морской свинки использовали 1; 2,5;

5; 10; 25%-ные водные растворы 1 аминопропилтриэтоксисилана с целью аминирования поверхности стекла. При этом

50 концентрация эритроцитарной взвеси морсКоА свинки оставалась f1ocTGAHHGA.

В дальнейшем были использованы различные временные интервалы процесса аминирования . 2, 5, 15 и 30 мин и темпера55 тура l00 и 22 С.

Для опоеделения длительности инкубирования ЭУС на аминированной поверхности стекла задавались временные интервалы:

5, 10, 20 > 45:,ин при сохранении постоянства вр-t .û;è и температуры оминировония, -неудовлетворительный монослой (занимает 40% площади стекла, в полях зрения плавающие эритроциты).

+монослой занимает 80% площади

5 стекла, в полях зрения плавающие эритроциты.

++монослсй занимает 100% площади стекла; в полях зрения плавающие эритро-. цит ы отсутствуют, 10 7 -Аминопропилтриэтоксисилан используется для создания ковалентно-закрепленных аминогрупп на силанольной поверхности (силохром, силикагель, пористое стекло и др,), что позволяет в

15 дальнейшем использовать их как основу для модификации с целью иммобилизации белков.

Таким образом, g-аминопропилтриэтоксисилан применяется для приготовления

20 сорбентов на основе силохромовых матриц.

Использование "аминопропилтриэтоксисилана с целью получения монослоя клеток неизвестно.

Предложенное вещество обеспечивает

25 модификацию стекла таким образом, что аминогруппы находятся в прочной ковалентной связи с ним и в несколько раз большем количестве на единицу площади. Этим объясняется поочность прикрепления эритро30 цитов к стеклу, так как связь представляет собой не два слоя электростатических взаимодействий, а лишь один:

° 1756822 концентрации эритроцитарной взвеси и температуры инкубирования.

Таким образом, оптимальными режимами получения эритроцитарного монослоя на стеклянной поверхности являются исполь- 5 зование 2,5 -ного водного раствора у-аминопропилтриэтоксисилана с целью аминирования стекла при 100 С в течение

15 мин с последующей отмыокой и нанесением 4 -ной эритроцитарной взвеси при 10

22 С в течение 5 мин. Использование меньших концентраций и температур снижает качество монослоя, а повышение используемых концентраций приводит к непроизвольному расходу реактивов. 15

Предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов может быть использован для выделения спонтанных розеткообразующих лимфоцитов у крыс.

Известные способы выделения спон- 20

T3HHblx POK не позволяют получать их внеизменном виде и в достаточном количестве.

Предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов позволяет получать доста- 25 точное количество немодифицированных

РОК крысы, Пример, Лимфоциты тимуса, селезенки, лимфатических узлов брыжейки тонкой кишки, пеоиферической крови в концентра- 30 циях соответственно 5,3,3,2 10 кл/мл в объ6 емах по 10 мл наслаивают на монослой эритроцитов, полученный предлагаемым способом. Инкубируют чашки Петри 30 мин при комнатной температуре, затем 1 ч при 35

4 С в присутствии 20%-ной декомплемейтированной сыворотки морской свинки. Лимфоцитарную взвесь сливают, чашки тщательно отмывают средой 199 от непрек репившихся лимфоцитов к монослою, моно- 40 слой лизируют 2 мл дистиллированной воды в течение 15 с, разводят избытком среды, отмывают один раз этой же средой. ресуспендируют клетки в объеме 1 мл этой же среды, подсчитывают снятые с монослоя лимфоциты в камере Горяева. Подсчет ведут в 100 больших квадратах камеры и производят перерасчет на 1 мкл.

Повторное розеткообразование с лимфоцитами, выделенными с монослоя эритроцитов, составило 95% РОК.

Таким образом, предлагаемый способ получения монослоя эритроцитов отличается от известного сокращением в 4,5 раза времени получения монослоя, снижением трудоеМкости процесса. Способ позволяет получать высокое качество монослоя эритроцитоо, снимать с монослоя достаточное для использования число клеток лимфоидных органов, используя феномен розеткообразооания. Стоимость предлагаемого реактиоа в 100 раэ меньше, чем у известных способов (см. таблицу).

Анализ жизнеспособности клеток селезенки, снятых с эритроцитарного монослоя, определяемой с помощью 0,5%-ного раствора трипанового голубого, выявил 99% жизнеспособных лимфоцитов.

Формула изобретения

Способ получения монослоя эритроцитов для иммунологических исследований путем покрытия поверхности стекла водным раствором аминирующего агента, его экспозиции и последующего нанесения на него взвеси эритроцитов, инкубации и отмывки, отличающийся тем, что, с целью ускорения и улучшения качества целевого продукта, в качестве аминирующего агента используют 2,5%-ный раствор Р-аминопропилтриэтоксисилана, экспозицию осуществляют при температуре 100 С в течение 15 мин, а инкубацию эритроцитов — в течение

5-10 мин,