Фрагмент днк

 

Использование: биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: из R-плазмиды трансконьюгата клинического штамма E.coli выделена детерминанта резистентности к гентомицину размером 2273 п.н., содержащая неизвестный ранее ген аасС2а, определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4854156/13 (22) 27.06,90 (46) 15.09.92. Бюл. ¹ 34 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (72) С,Б.Вакуленко, Е.Г.Энтина, И.П,Фомина и С.М. Навашин (56) Allmansberger R. et al. Mol, Gen. Genet., 1985, 198, 514 — 520.

Vliegenthart 1, et al, Antimicrob, Agents, Chemother., 1989, ЗЗ, N 8, 1153-1159.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой фрагмент ДНК, обусловливающий синтез 3 -аминогликозидацетилтрансфера.

3 -аминогликозидацетилтрансфераза— фермент, продуцируемый клиническими штаммами микроорганизмов и обусловливающий инактивацию таких клинически важных антибиотиков, как гентамицин, тобрамицин, сизомицин и нетилмицин, в результате чего продуцирующий этот фермент штамм микроорганизма приобретает резистентность к перечисленным антибиотикам.

Известны детерминанты резистентности, кодирующие гены аасС2 и продуцирующие фермент ААС(3) — 11. Гены аасС2 выделены из штаммов, распространенных в Чили и Нидерландах, На основании известной нуклеотидной последовательности сконструирован ДНКзонд, представляющий собой Sphl-Sall фрагмент ДНК размером 0,8 т.п.н, „„. Ж„„1761806 А1 (si)s С 12 N 15/31 //(С 12 N 15/31, С 12 R1: :19) (54) ФРАГМЕНТ ДНК, СОДЕРЖАЩИЙ ГЕН

РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АМИНОГЛИКОЗИДАМ аасС2а, КОДИРУЮЩИЙ 3 -АМИНОГЛ И КОЗ ИДАЦЕТИЛТ РАН СФ Е РАЗУ ТИПА

11а (57) Использование; биотехнология, генетическая инженерия. Сущность изобретения: из

R-плазмиды трансконьюгата клинического штамма Е.coll выделена детерминанта резистентности к гентомицину размером 2273 п.н., содержащая неизвестный ранее ген аасС2а, определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты. 2 табл.

Целью изобретения является создание

ДНК-зонда для выявления неизвестного ранее гена аасС2а.

Типы аминогликозидинактивирующих ферментов можно определить по профилю резистентности штаммов к аминогликозидным антибиотикам. По профилю резистентности, детерминанта устойчивости, клонированная нами, кодирует фермент типа AAC(3) — 11а, не описанный ранее и отличающийся по профилю резистентности от фермента типа AAC(3) — 11 более высоким уровнем резистентности к изепамицину— аминогликозиду, используемому для определения типов ферментов, инактивирующих гентамицин.

Для выявления штаммов микроорганизмов, содержащих ген, кодирующий фермент AAC(3)11а, необходимо выделить детерминанту резистентности содержащую распространенный в

СССР ген 3 -аминогликозидацетилтрансферазы типа 11а и на основании его нуклеотидной последовательности сконструировать ДНК-зонд.

Этот зонд, используемый для выявления гена аасС2 в клинических штаммах микроорга1761806 низмов, может применяться в химиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфекций.

Для достижения поставленной цели из

R-плазмиды трансконьюганта штамма

Е,coll, продуцирующего фермент ААС(З)—

11а, клонирована детерминанта резистентности к гентамицину, представляющая собой Hind II I фрагмент размером около 2,3 т.п.н„и при помощи метода Сангера определена нуклеотидная последовательность этой детерминанты резистентности, Нуклеотидная последовательность Hind III фрагмента содержащего ген аасС2а, приведена в табл, 1.

Ген, входящий в состав секвенированной детерминанты резистентности, содержит открытую рамку считывания размером 856 п,н„ кодирующую фермент ААС(3) — 11 и локализованную между 819 и 1676 нуклеотидами, начиная от 5 конца. Показано, что ген кодирует белок с мол.м, 30,6 килодальтон. Выявлено, что секвенированный ген содержит отличный от известных ранее промотор и ряд нуклеотидных замен в структурной части, Эти изменения позволяют отнести секвенированный нами ген к типу аасС2а.

B табл. 2 представлены регуляторные области гена аасС2 из плазмид рИ/Р14а, рВ/Р116а и р) ЧОЗ, а также секвенированного гена аасС2а. Регуляторные области гена аасС2 из плазмид рИ/Р14а и рВ/Р116а идентичны регуляторной области плазмиды

pJVO3 за исключением участка протяженностью 20 п,н„присутствующего в промоторной области плазмиды р /ЧОЗ, Последовательность длиной 20 п.н. плазмиды р /ЧОЗ содержит альтернативный — 10 бокс промотора, В регуляторной области секвенированного гена в направлении к 5 концу, начиная от старт-кодона, расположен участок длиной 18 п,н„совпадающий с таковыми регуляторных областей генов аасС2 плазмид р1ИР14а, pWP116a и рЛЧОЗ, В этом участке расположена последовательность ШайнаДальгарно GG AG. 3a гомологичным участком расположена последовательность длиной 9 п.н., отсутствующая в генах, секвенированных ранее, Далее вновь следует область длиной 8 п,н., присутствчюшая в плазмидах

pWP14a,рМ/Р116а и pJV03. Вслед за участками гомологии в гене из плазмиды pSV11 (плазмида pUC19, содержащая Hind III фрагмент с геном аасС2а) следует протяженная область, абсолютно отличающаяся от регуляторных областей генов аасС2 плазмид

pWP14a, pWP116a и pJV03.

При сравнении структурной части секвенированного гена с геном из плазмиды

pWP113a показано наличие 3,57, замен нуклеотидов и 5,6 аминокислотных замен в молекуле фермента. При сравнении структурной части секвенированного гена со структурными частями генов аасС2 плазмид

pWP14a, pWP116a и р) ЧОЗ выявлено 3,15 нуклеотидных замен и 4,2 аминокислотных замен в молекуле фермента, На основании этих данных можно сделать вывод, что секвенированный нами ген эволюционно ближе к гену из плазмид pWP14a, pWP116a и pJV03.

При сравнении последовательности структурной части секвенированного гена с последовательностями структурных частей генов аасС2 плазмид pWP14a, pWP116a, pJV03 и pWP113a обнаружено в общей сложности 43 нуклеотидные замены, определяющие 20 аминокислотных замен в молекуле фермента, т.е. наблюдается 5 0 7 различ..й в нуклеотидном составе и 7,3 /— в аминокислотном. Нуклеотидные замены, обусловливающие замены аминокислот в последовательности гена, локализованы достаточно случайным образом. На основании определения степени гомологии секвенированного гена и известных генов аасС2, секвенированный ген отнесен к типу аасС2а.

Для достижения цели сконструирован

ДНК-зонд, основанный на неизвестной ранее заявленной нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, содержащего ген аасС2а. ДНК фрагмента размеров 2273 п,н. подвергнут гидролизу эндонуклеазой рестрикции EcoR V, образовавшиеся фрагменты разделен методом электрофореза в агарозном геле, фрагмент размером 537 п.н. элюирован из агарозы, очищаем при помощи двукратной экстракции фенолом и двукратного осаждения этанолом. Полученный таким образом фрагмент ДНК радиоактивно или нерадиоактивно метят и используют в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации.

Пример. Клетки клинического штамма

Е.coll 164, резистентного к гентамицину, тобрамицину, сизомицину, нетилмицину и продуцирующего фермент ААС(3) — 11а, выращивают в L-бульоне в течение ночи при

37 С, Из бактериальной суспензии изолируют ДНК R-плазмиды, имеющую мол.м. 70

Мд и содержащую детерминанту резистентности к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и нетилмицину. Выделенную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции

Hind III и лигируют с ДНК векторной плазмиды pUC19, гидролизованной эндонуклеазой Hind ill, Смесью, содержащей лигированные молекулы. трансформируют реципиентный штамм Е.cali JM 101, Транс1761806 форманты, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирают на агаризованных средах, содержащих гентамицин в концентрации

10 мкг/мл. Отобранные трансформанты рассевают до отдельных колоний на агаризованной среде LB, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, Отдельную колонию выращивают в жидкой питательной среде LB в течение ночи и выделяют ДНК щелочным методом. Проводят в стандартных условиях гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазной рестрикции Hind III è в присутствии маркеров молекулярной массы устанавливают, что детерминанта резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину находится в составе Hind III фрагмента размером 2,3 т.п,н, При помощи метода Сэнгера определяют нуклеотидную последовательность клонированной детерминанты резистентности.

В результате компьютерной обработки результатов ген отнесли к типу аасС2а.

Из лабораторного штамма Е.coli, содержащего рекомбинантную плазмиду pSV11, щелочным методом выделяют плазмидную

ДНК в препаративных количествах. Проводят рестрикцию плазмидной ДНК эндонуклеаэой Есо RV. Фрагмент размеров 537 п,н. вырезают из геля, проводят электроэлюцию в диализный мешок, очищают двукратной экстракцией фенолом, двукратным осажде5

30 нием этанолом. Радиоактивное мечение фрагмента проводят реакцией ник-трансляции. Радиоактивно меченый фрагмент используют в качестве зонда в экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации.

Таким образом, определена нуклеотидная последовательность гена аасС2а, Сконструированный на основании этой последовательности гибридизационный зонд, представляющий собой Есо RV фрагмент размером 537 п.н„может быть использован для выявления этого гена. Полученный в результате осуществления поставленной цели зонд радиоактивно или нерадиоактивно метят и используют в экспериментах по ДНКДНК гибридизации, Результаты, полученные при гибридизации со сконструированным из

ДНК гена аасС2а зондом, могут применяться для рационального выбора антибиотика в химиотерапии гнойно-септических и особо опасных инфекций.

Формула изобретения

Фрагмент ДНК, содержащий ген резистентности к аминогликозидам аасС2а, кодирующий 3 -аминогликозидацетилтрансферазу типа 11а, полученный в результате элюции из геля продукта гидролиза рестриктазой Hind III рекомбинантной плазмиды рЯИ1, реплицируемой в лабораторном штамме Escherichia coli

KI2, размером 2273 п.н. со следующей нуклеотидной последовательностью.

17б180б

Таблица1

Со 20 а0 50 е0 70 80 ЕО !ОО 1!О

1 TTTGET4CTC TCAEAATACC CTTTTGAGTT СбiTTTTGTG CCAACRGAAC йВСССБТАВБ ТА44ТСТСБВ AGCATTTCAG BAAGTGTCTB TGTGAGTTGA РТСТбййТББ

111 СДБТТААТйТ TTTASTBGTC 4466ТСТтдб БСБАСТТ6АА ТБСДВББСад CCTCGTTTTT TGGCAGBCGB ТТТТйС4РС4 ВбйбббйбйА CTATTTTCTC RACRCCTTCE

221 CGTKTGGAA iCATDGTTGC ДТСйС664СТ ййтДТбдсiG йТТААСБТ4Т ССБСРДВАТГ GEACTTCACC ЯТСТБСТСАТ GAACGCGABT DGTTAGTTTA CGCGCTGCAA

551 ATTCAKAAA ARCACCGCTA AATGTCCCTT СБСТБББТйб TTTTTTATAC ABATTBAABC СЕСAAATTCG CCGCAATCTA CGATCAACTT CTABGC6TTC AATCAAGCCC

441 СБТВТББТВА CGATACCAAG ТТСАВСТТТТ БCAATAAAAE БсйСРГВССЙ 44ССВСйбсб GTCAKAGGA GBTCTTCCCA СйбСйСАССС TTGATATTGD TATACCAAGG

661 ССБТТБТТТБ 4G4AAAGGGC

AABGCAATRA CBGAGGCGCT rCAAAAACTC GGAGTCCAAA CCBCTBACCT

771 ВСТ6ТТТБТ6 ERGTTTTGCR

CGTTGCiGCG TT4CKTCCG СББТТ666СС бйСТ66СДСТ 6ТБйтВББРТ

SS! АсбойТСБТ6 ССйССБАТСА СССТАС6466 ДбйсТСЕГНй ТбаСВСТСББ ТТСбйТбйСй ййАСССЕССВ TACCTEE CB CCGTTCGATC CCGCAAC6EC СЕЕ64СТТАС

1!01 CбТ6ВБТТС6 ВССТБСтбйй TCAGTTTCTG гТТСййБССС ССББгбсбСБ БСБС4БСБгб CAKXGATG СДТСБДТББТ CKGGTTBGT ССйСТБ6СТБ йййСБСтбйг

1211 ББДБССТСйС ААССТСВБТС йССССТТЕББ EGAAGEEÒC6 СССБТСЕАСС GETTCGTTCE CCTTGGCE66 AAGSCCCTGC TGTTGGGTGC KCGCTAAAC TCCGTTACCG

1521 СйТТССйСТй СБССайббсб ВТТЕССбйТА ТССССААСйй НС66СБББТБ 4СБТРТбдбй ТВССВАТБСТ ТВБЯАССРРС ББСЕААБТСВ ССТББАААДС ВВСРТСББйТ

1451 ТАСВйТТСАА йС66САТТСТ СбйТТЕСТТТ CCTATCCAAG GAAAGCCGGA TECEETCBAA TATAGCAA ATCCTTACGT BAAKTCGGT CECCATC6AG AAGGTGTCGT

1541 EDDCTTTGCT CAGTGCTACC ТВТТСбйСа 6 и БДСАТС GTEACGTTCG DCGTCACCTA ТСТТБйаййб СйТТТС6644 CCACTCCGAT CGTKCAE 4 СйС6446ТСБ! а51 CCEAGTECTC TTGCGAEC Т ТС486ТТАБА ББССБТСБНС ДРТБАТйАТС TGBATCAACE ЕАССТТТСБС СБСБСбйййб ACGRCGCTCE СТБРВС66ТТ ВСБСВйТСЕБ

17а! СВТТССАДАТ CSCTEATCTT TGACCCCERG САДДТС666Т ТСБТТБТБйй йайййССБТС CCCATGCC6G СбйБСабйбй Стдтсйббйт СТССТйТТАТ БСДРТТАРТ

1871 сддйййстбс ссйбдййбтт RATAATcTRB йдттстттсс сттбйбтйтт cAAAGGAAci тстййтйййт 4ттйттсййб ййдйтАйдсй дтстйттсдй дддйттбддБ C1 Дйд ATTACA ТАССЙтйДТД ССТETTCAGT ТйТСТбййбй тТСТайййДТ ВААГН:,, -4С GAETEÑÒGÒÑ йййРТСДДТА AAiGCAECAT ТТйййййСТБ CGC АБССАЯД

2091 БДДВБДВДДД ТТАТ"CRASS ЕСРДСДСРТД ДНТРРВттДЕ тдбдйтбтс

2 01 СДРТТТСТТА 446ТТСТРБТ ДГТСЙ::ATC Абгтбстттб Аддтттсййт A TiiCCRТР СССТБСТТТТ Тйй

551 ATTCGATGTC ACTCCACTCE AGCACACGAA тддтссбттс EAECTTTGAE стсдтбссбт

TTA4TGTAET йТТСРТБСТВ тдбйТБТТйб GGTGTTGGTT

iieet

AGTGCCTCGA TTT4EAGBAS ДТДТгбсбДТ БСДТДгбгаб

881 йТТайТВБТВ CATGCCTCAi ТТАййБСбйт ТБВТ Саб!С бййббйббйб CEDAGACEGT

CCTAAATCGG CTECGACTAA AGGAATAAGT ТСБТАТТВТА йббсТТБААА

-55 ТТВАС4 -10 TATAAT

Тйбй4БСТСА TTTTAACATC TACAACTTTT ТТСДРДАААТ GTTAATTCAE

)О ) 76 ) 80б

Таблиц (сИР1ЫА) Net His Thr!Aro! Lvs Ala Ile Thr Glu Аlа;Ilе1 Arolbys Leu 51ч Va! (pSV1!) 1,et His ThrlAro! !Lys Ala llе Thr Glu Ala!Leu! !61п! ys- Сеи 51) Val (оИР115A) Net His Thr!Gln! Ly«Ala Ile Thr Blu A!a!Leu!15!nlLv» (ец Glv Ча) 3,!J) 51 п ТЬг !6)у) Аьр Leu ец Het Val His Аl а Бег Leu Lys Ala 1 1е Sly Рго Val 61!

17 51п Thr !61у!А«р Leu Leu Ие Val His Ala Бег eu уь!А1а!11е Gly Pro Val "lц

Gln ТЬг !Бег!Аьр бец 1.ец,et Val His Ala Ser Leu LyslSer Iile Gly Ргс Чаl Blu

) ) l

61у Ну Ala Blu Thr Чаl Ча! йlа йlа Leu йгс Бег йlа Чаl 51у Рго Thr Ну Тиг .6 Ну Glv Ala Нц Thr Val Val Ala Ala Leu йгс Бег Ala Val Bly Рго Т г 5! у Thr

Gly Gly Ala Blu Thr Val Val Ala Ala Leu йгс Бег Ala Val Gly Рго Thr 5)y Thr

Va1 Net Gly Туг Ala Бег Тгр Аьр Arg Бег Рго Туг Blu Glu ТЬгЕец:А»п Bly А)а

5 v Ча) )>et 6) у Туг Д)а Ser Tro Д»о Дгс Ger Ргс Туг Нц Нц Т г !Дгс) А»п Llv Д)а

Чаl Met 51у Туг йlа Бег Тгр Aso Агс Бег Ргс Tvr Glu 51ц Thrlbeu)Aеп 6 у йlа

) Aro Leu Asp АьрГуь1 l la1Arg Arg Thr Тгс Ргс Pro Phe Asp Рго Ala Тиг А!а 5)ч

74 Aro Leu Asp Аяр!(у»!!Тйг!Дгс Arg Thr Тгр Pro Pro Phe Asp Ргс Ala hr Дlа 5!у

Aro Leu Asp Asp !Asn ! Ala !Aro Aro Thr Тгр Pro Pro Phe Aso Рго Ala Thr йlа 5!у

) 3 ) 3

Thr Tyr Aro Bly Phe Glv Leu .гц Asn Bln Phe .ец Val Bln Ala Рго 5!у Аlа Arg

93 Thr Tyr Агс Gly Phe Gly Leu Leu A»n Gln Phe Leu Чаl 6!n Ala Ргс Еу А!а Агс

Thr Туг Aro Gly Phe Gly Leu Leu Asn 6)п РМ Leu Чаl Bln Ala его Gly й!à Агс

I!е Чаl Thr Р).е 51ч Чаl :-г -. Сец Сlц

Ile Val Тиг Phe 5!ч Ча) Тйг Vr Leu 5, 1Iе Чаl Thr Phe 61у Ч-, .;- Тя- ец Нц

Cvs Туг Leu Phe Asp Ala Gln Asp

Cys Tyr Leu Phe Aso Ala 6ln й«о

Cvs Tvr Leu Phe Asp Ala 61п Aso

His Phe 61у A1aiThr гго Ile Val

His Phe Bly!ThrlThr Pro I1e Va!

His Phe Gly!Thr!Thr Pro Ile Val 1 Л

Pro Ser Cly

Рго Ser Gly

Рго Ser 61у

Gln

245 61п

51п

Рго Ala Hi» ".lulA!a! Ala !5!n . Агс;Бе» С1 =

Pro Д!а His 61ц!Чal ) !А1а! !Бlц! ICvs ISer Су».

Ргo Ala His 5)ц й)а! !)l-е! !5 ц! )Агс!Бег Cvs

3)

Lys

2Ь4 у»

Lv»

6lu

26ç 51ц

61ц

Агс Ser Ala His Pro Aso Ala Бег Nnet Чаl Ala Val Gly Ргс eu Ala Glu Thr Leu

112 Aro Ser Ala His Pro Asp Аlа Ser Net Ча) Ala Ча) B!v Pro Leu A!a Н л Thr Leu

Дга Ser Ala His Рго Aso Ala Бег Ме1 Ча! Аlа Ча) 61у Рго eu йlа Glu Thr I eu

Thr Glu Рго His Glu!Leu 61у His Аlа Leu Gly Glu Glv Ser Ргс Ла1 Нц Агс Рпе

° 131 Thr 61ц Рго His!Lys!Leu G!y His Ala Leu Glv Бlц Gly Ser Ртс,Ча1)5)ц Агс Phe

Thr Glu Pro H! s |61u ) ец 6!v His Ala Leu 61 v Glu Glv Бег Рго г й»и,,6!ц Arg Phe

Val Aro Leu Gly Gly Lys Ala Leu Leu Leu Gly Ala Рто Leu Asn Бег Чаl Тhr А!а

150 Чаl Аго Leu 51у Gly Lys Ala Leu Leu Leu 5!y Ala Рго Leu Asr. Бег Vаl Thr Ala

Val йгс Leu Gly Bly (уь Ala Leu Leu Leu Gly Ala Рго (ец йег Бе Чаl Thr A!a

Leu His Туг Ala Нц Ala Чаl йlа Аер Ile Pro Asn Lys Aro!)ro!Va1 Т) г Tyr B!u 169 Leu His Tyr Ala 6!u Ala Val Ala Asp Ile Pro й»п,. Агс Arg, )а1 Ttr Туг 51ц

Leu His Туг Ala Glu Ala Val йlа Asp Ile Pro Asn ) уе йгс !:го)Ча1 Тпг Туг 61ц

Ий Pro Ие) Еец)61у éAãràg l!А»п)61у 51ц Ча) Ala Тгр Lys Т"г Ala Ser;CI,Òóã й=с

186 ))е(Pro )(е) !).ец!61у!Бег!!й п .Gly Glu Val Ala Tro Lv« Th)- Ala Бег!й= » Туг Asp

Net Pro Net!Pro!Sly!Aro!!Asp!6Iy Glu Va1 Аlа Тгр ys Т).г А!а Бе:-,йес,Туг йеэ

Ser A»n Bly 11е Leu А«о Сч» РЬ е йlа 1!е 51ц Blv Lv-s „Pãñ. А»с а V 51ц т г

207 Ser A»n Glv Ile Leu A»p Су» Рп- А)а 1)е 5!ц 51у у»!Ргс,А»: й) а Ч;1 Е; Тпг

Asn Bly Ile 1ец й«о Су« Р) е Д)a 1)е 6)u Н у Су )5)и,й»р А>а Ча1

Ile Ala Asn Ala Tyr Vai Lvs Leu 5!v Aro Н: « йгс 5!u b!v ",=a- Val " ; ne А,226 Il,e Ala и п Аlа Tyr Чаl Lys (.ец Ну Дгс His йгg 51ц 51у Ча) Ч»1 = !v :=,е Аlа

Ile Ala Asn Ala Туг Чаl бч Leu 61у А»с His йгс 5!и ЬЬ Чаl Va! :-!v Рие A! a