Способ получения иммунной хламидийной сыворотки

 

Использование ветеринарная микробиология , биотехнология, иммунная сыворотка , диагностические препараты, хламидиоз. Сущность изобретения: возбудитель хламидиозного аборта овец, выращенный на желточной оболочке куриных эмбрионов, подвергается очистке и концентрированию путем центрифугирования дифференциального и в ступенчатом градиенте сахарозы. В дальнейшем взвесь элементарных телец хламидий (содержание белка 120 мкг/мл) инактивируется 0,4%-ным формалином (конечная концентрация), смешивается с неполным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:2 и однократно внутримышечно вводится несуягным овцам в количестве 10 мл (по 5 мл с внутренней поверхности бедра в обе конечности). Через 1 месяц после инъекции антигена овцы тотально обескровливают, отделяют сыворотку и консервируют фенолом. 3 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я)5 А 61 К 39/395

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4747359/13 (22) 06.10,89 (46) 07.12.92.Бюл. М 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ветеринарный институт (72) P,А.Шафикова, P.Н.Сафин и А,З.Равилов (56) Временная инструкция по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоэного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз, ГУВ Госагропрома

СССР, 1987. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ

ХЛАМИДИЙНОЙ СЫВОРОТКИ (57) Использование; ветеринарная микробиология, биотехнология, иммунная сыворотИзобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к способу получения иммунных сывороток, и может быть использовано при производстве диагностических препаратов.

Известен способ получения иммунной хламидийной сыворотки путем заражения суягных овцематок возбудителем хламидиозного аборта овец и забора крови через 1 мес после аборта.

Недостатками прототипа являются: зависимость от физиологического состояния овец; отсутствие точного метода определения срока суягности овец; использование живого возбудителя хламидиозного аборта овец — в некоторых случаях наблюдается, ». Ж, 1779383 А1 ка, диагностические препараты, хламидиоз.

Сущность изобретения: возбудитель хламидиоэного аборта овец, выращенный на желточной оболочке куриных эмбрионов, подвергается очистке и концентрированию путем центрифугирования дифференциального и в ступенчатом градиенте сахарозы. B дальнейшем взвесь элементарных телец хламидий (содержание белка 120 мкг/мл) инактивируется 0,4 Д-ным. формалином (конечная концентрация), смешивается с неполным адьювантом Фрейнда в соотношении 1;2 и однократно внутримышечно вводится несуягным овцам в количестве .10 мл (по 5 мл с внутренней поверхности бедра в обе конечности). Через

1 месяц после инъекции антигена овцы тотально обескровливают, отделяют сыворотку и консервируют фенолом. 3 табл. гибель и неспецифические аборты из-за токсического действия хламидий; невысокая активность сыворотки при получении в производственных условиях, Целью изобретения является упрощение способа получения иммунной хламидийной сыворотки, повышение ее активности и специфичности, Поставленная цель достигается тем, что несуягным овцам или баранам однократно внутримышечно вводят очищенные и концентрированные элементарные тельца возбудителя хламидиоэного аборта овец после инактивации формалином в смеси с неполным адъювантом Фрейнда в

1779383 соотношении 1:2. Через 1 мес после инъекции антигена овец тотально обескровливают, Пример 1. Возбудителем хламидиозного аборта овец заражают 300 куриных эмбрионов (КЭ) в желточный мешок. КЭ, погибшие в первые 3 дня после инокуляции, выбраковывают, а погибшие на 4-10 дни вскрывают для отбора желточной оболочки.

Для приготовления антигена — иммуногена используют 10 -ную взвесь желточных оболочек КЭ, приготовленную на 0,2 М фосфатном буфере (ФБ) рН 7,2-7,4 путем растирания в ступке. Хламидии из 10%-ной взвеси концентрируют и очищают путем центрифугирования дифференциального и в ступенчатом градинте сахарозы по следующей схеме:

10 -нэя хламидийсод ржащая взвесь; центрифугирование при 2500 об/мин в течение 20 мин; 1 центрифугирование надосадочной жидкости при 18000 об/мин в течение 40 мин; гомогенизация осадка в 0,01 M ФБ рН

7,2-7,4, наслоение на 30 -ную сахарозу на

0,01М ФБ и центрифугирование при 20000 об/мин в течение 60 мин; . гомогенизацйя осадка в 0,01М ФБ и наслоение на ступенчатый градиент сахарозы (снизу вверх 60, 45 и 30 ) и центрифугирование при 20000 об/мин в течение 60 мин; сбор хламидий между 45 и 30;(,-ными растворами сахарозы и отмывание в 0,01М

ФБ путем центрифугирования при 18000 об/мин в текчение 40 мин; гомогенизация осадка в 0,2М ФБ, определение оптической плотности взвеси хламидий на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм и вычисление количества белка в 1 мл.

Взвесь хламидий с содержанием белка

120 мкг/мл инактивируют 0,4 -ным формалином (конечная концентрация) при 37 С,в течение 5 сут, смешивают с неполным адьювантом Фрейнда в соотношении 1;2 и вводят несуягным овцам или баранам внутримышечно с внутренней поверхности бедра в обе конечности (по 5 мл в каждую сторону). Через 1 месяц после иммунизации производят тотальное обескровливание и исследуют сыворотки в РСК и РЭМА на содержание специфических хламидийных антител (табл,1).

Как свидетельствуют данные табл.1, внутримышечное введение несуягным овцам как живых, тэк и инактивированных хлэмидий в смеси с неполным адьювантом

Фрейнда позволяет получить высокоактив5

55 ные сыворотки, Антитела к контрольному антигену, изготовленному из желтолчных оболочек неинфицированных КЭ, в хламидийных сыворотках ни в РСК, ни в РЭМА не обнаружены.

Пример 2. Проводились опыты с целью выяснения влияния способа введения спекцифического антигена íà серологическую активность иммунной сыворотки.

Антиген для иммунизации готовят так же, кэк и в примере 1.

Смесь антигена с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:2 вводят несуягным овцам или баранам внутрикожно вдоль позвоночника с обеих сторон (в 15 точек с каждой стороны по 0,35 мл), Общий объем введенной смеси составляет 10 мл, Через 1 месяц после инъекции антигена производят тотальное обескровливание и исследование сывороток крови в РСК и РЭМА нэ содержание специфических хламидийных антител (табл,2).

Как видно из табл.2 внутрикожное введение хламидий в смеси с неполным эдъювантом Фрейда также приводит к выработке высокоактивных и специфических антител.

Однако следует заметить трудоемкость внутрикожного способа инъекции антигена по сравнению с внутримышечными, особенно в производственных условиях, Пример 3. Опыты по сравнительному испытанию предложенного способа по изобретению и по прототипу;

С этой целью в качестве подопытных животных берут 3 группы по 5 голов:

1 группа (п рототип) — овцы 2,5-месячной суягности, которых заражают интратрахеально и подкожно по 5 мл 20/-ной взвесью желточных оболочек КЭ, инфицированных возбудителем аборта овец, имеющей инфекционный титр в 10 КЭЛД щ/0,3 мл;

2 группа (по изобретению) — несуягные овцы;

3 группа (по изобретению) — бараны возраста 2-3 лет, с живой массой не менее

45 кг. Животных 2 и 3 групп иммунизируют согласно схеме по примеру 1 инактивированным возбудителем, Из 1. группы 1 овца оказалась несуягной.

Иммунная хламидийная сыворотка у овец этой группы получена через 2 месяца после заражения, у животных 2 и 3 групп — через

1 месяц. Результаты излучения активности сывороток в РЭМА и PCK представлены в табл.3.

Данные таблицы показывают, что предлагаемый способ позволяет изгото1779383

Формула изобретения

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

* Приведены обратные величины титров антител.

Составитель P.Øàðèïoâà

Техред M.Ìîðãåíòàë КоРРектоР С Пекарь

Редактор

Заказ 4402 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 вить высокоактивную и специфическую хламидийную сыворотку и упростить технологию ее производства эа счет замены суягных овец несуягными или баранами.

Технико-экономическая эффективность 5 предложенного технического решения в сравнении с прототипом заключается в замене суягных овец несуягными или баранами для получения иммунной сыворотки, необходимой для набора антигенов и сыво- 10 роток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз и разраба- 15 тываемых наборов для выявления хламидийных антител и антигенов в РЭМА, Способ получения иммунной хламидийной сыворотки, предусматривающий однократную иммунизацию продуцентов антигеном из очищенных и концентрированных хламидий, взятие крови с последующим выделение целевого продукта, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения активности. специфичности и выхода сыворотки, в качестве продуцентов используют несуягных овец или баранов, а иммунизацию проводят внутримышечно антигеном иэ иннгктивированной культуры возбудителя хламидиоза с неполным альювантом Фрейнда, взятых в объемном соотношении 1:2 соответственно,