Способ получения антигенного препарата, обладающего адгезивными свойствами, из фимбрий

 

Изобретение касается получения антигена из фимбрий. Способ получения антигенного препарата из фимбрий состоит в том, что выделяют в ДНК из уропатогенного штамма фимбрий Escherichia coli с последующим субклонированием данной ДН К в векторы. Получены ряд плазмидных ДНК рРАР14,рАР115. рРАРЭ, рРАР16, рРАР17, рРА138, рРАР4, рРАР32, рРАР58, рРАР54, рРАР502, рРА504, рРАР503, рРАР507 с геном рарЕ и papG, трансформируют полученными ДНК штаммы Escherichia coll, выращивают трансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с помощью аффинной хроматографии. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4001551/13 (86) РСТ! 0К 85/00045 (02.05,85) (22) 02.01.86 (46) 07,01.93. Бюл, N. 1 (31) 2190 (32) 02.05.84 (33) 0К (71) Симбиком Актиеболаг (СН) .(72) Фредерик Карл Петер Линдберг, Бьерн

Олоф Лунд, Бритт Моника Бога, Мари Элизабет Норгрен, Микоэл Геранссон, Берит

Эрик Анунд Ухлин, Ян Стаффан Нормарк (СН) и Дэвид Ли Ларк (US) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО

ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО АДГЕЗИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ, ИЗ cDИМБРИЙ

Изобретение касается получения антигена из фимбрий.

Хорошо известны антигены, состоящие из нескольких белков, которые совместно образуют индивидуальный фенотип в патогенном бактериальном штамме или видах, содержат большое количество иммуногенных детерминант. Однако, такие антигены и полученные из них вакцины имеют целый ряд недостатков.

При иммунизации этими антигенами образуются антитела, направленные против каждой из этих иммуногенных детерминант, которые вместе друг с другом идентифицируют один специфический бактериальный штамм, иэ которого образован антиген, но не идентифицируют других бактериальных штаммов тех же видов.

Предложен способ получения антигена, который включает иммуногенную детерминанту или иммуногенные детерминанты, и

„„5U 1787165 АЗ (я)ю С 12 N 15/31//(С 12 N 15/31, С 12 и 119) (57) Изобретение касается получения антигена из фимбрий. Способ получения антигенного препарата из фимбрий состоит в том, что выделяют в ДНК из уропатогенного штамма фимбрий Escherichia coll с последующим субклонированием данной ДН К в векторы. Получены ряд плазмидных ДНК рРАР14,рАР115, рРАР9, рРАР16, рРАР17, рРА138, рРАР4, рРАР32, рРАР58, рРАР54, рРАР502, рРА504, рРАР503, рРАР507 с геном рарЕ и papG, трансформируют полученными ДНК штаммы Escherichia coll, выращиваюттрансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с помощью аффинной хроматографии. 3 табл, которые не ограничиваются одним специфическим штаммом патоген н ых бактерий.

Каждый рецептор склеивается с различными адгезивными структурами, Этот рецептор может представлять собой пептидный рецептор или углевод, например нейрамовая кислота (2-3)-галактоза, манноза-c(1 — 2)-ман ноза или дигалактозид а — 0-Ga1p-(! - 4)-Р-0-GA1p группа присутствует в цепях гликолипидов и в данном контексте будет называться глобозидом, Полученный антиген в качестве основного иммунизирующего компонента включает детерминанту адгезивного полипептида или его иммуногенно активную последовательность или его предшественник, который способен превращаться в иммуногенно активную форму, антитела, против которых детерминанта реагирует с адгезивным полипептидом, который обра1787165 зует патогенные дающие адгезин бактерии, и который склеивается с тканью млекопитающих животных, Этот антиген может включать аминокислотную последовательность, включающую не менее пяти аминокислот, вплоть до полной аминокислотной последовательности адгезивного полипептида.

Адгезивный полипептид наиболее успешным образом может быть получен иэ образующих адгезин бактерий, Эта группа бактерий включает как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии; бактериальные виды, представляющие наибольший интерес для данного изобретения, из которых наиболее успешно получаются один или большее число видов адгезивных полипептидов, включают: уропатогенные или энтеропатогенные штаммы Escherlchia соИ или другие кишечные или ростовые бактерии, Neisserla gonorrhocae, Neisseria

meningitidis, Nelsseria catarrhalis, Yersinia

spp., Pseudomonas aeruginosa или другие

Pseudomonas зрр„МогахеИа bovis или другие Moraxella spp., Bactегоides nodosus, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. или

Bordetelia spp. такие как Bordetella

pertussis, Наряду с этим адгезивный полипептид может быть получен. путем синтеза, как описано ниже.

В некоторых патогенных бактериях данной группы нитевидные структуры, заканчивающиеся пили (волосяным) краем (pili), идущим от стенки клетки, некоторым образом могут быть связаны путем адгезии.и, следовательно, а также ввиду того, что волосяная структура (пила) легко очищается— все препараты пили используются как антигены в вакцинах, например, антиген гонококкус пили, испытанный в армии США

Исследователи, работающие ранее над препаратами пили, сделали много усилий, чтобы получить чистый белок пили, достигнутые этими исследователями результаты были успешными в том отношении, что полученные ими препараты показали лишь одну полосу в гелях SDS.

Полученные белковые препараты пили проявляли по меньшей мере три функции.

Первая функция — зто способность образовывать полимеры, по всей вероятности, за счет процессов гидрофобного связывания; это очень важное свойство, способствующее возможности образования волосовидной нити (пили) из мономерных субмолекулярных структур. Вторая функция— зто способность порождать антитела, это свойство, которое играет основную роль для использования белка и в качестве вакцины.

Третья функция — это способность склеи5

25

35

55 ваться с рецепторами поверхности клетки, Поскольку исследователи не были в состоянии идентифицировать более чем один белок в их волосяных (пили) белковых препаратах, а также в самих пили, то был сделан вывод, что пили представляют собой полимерные агрегаты, состоящие из идентичных мономерных белковых субмолекулярных структур, причем каждая из этих субмолекулярных структур обладает всеми тремя указанными выше функциями.

Однако, как указывалось выше, неповрежденный цельный пили от одного единст° венного бактериального вида имеет огромную антигенную разновидность, Кроме того, было продемонстрировано, что при использовании в качестве вакцины, неповрежденное целое пили одного антигенного типа образует антитело, являющееся основной для указанного единственного антигенного типа, а не разделенных антигенов пили. В более ранних работах исследователи осуществляли химическое расщепление очищенных пилусовых субмолекулярных структур на фрагменты, имеющие указанные функции, Каждая отдельная функция была идентифицирована с отдельным фрагментом очищенной пилусовой субмолеку-. лярной структуры. Таким образом, можно считать, что очищенные препараты белка пили содержат единственный белок — пилиновый мономер. Этот пилиновый мономер химически расщеплен и имеет связывающую функцию и основную антигенность — то же, что полимеризованный чистый пилусовый белок, Однако обширные исследования, проведенные авторами, показали, что предлагаемый чистый белок пили фактически состоит из нескольких белковых фракций.

Подтверждением данного наблюдения являются другие мутированные организмы, сохраняющие распознаваемые волосяные структуры, но неспособные к адгезии, В ре5 зультате дальнейших наблюдений установлено, белок пили. который ранее предполагался как чистый, должен включать не менее двух фракций, одна из которых представляет собой структурный элемент, составляющий фактическую формацию пили и другая — представляет собой фракцию, ответственную за адгеэионную способность, Тот факт, что обе фракции обладают антигенными свойствами, открывает возможность порождения антител, направленных против ответственной за адгезию фракции.

Для бактерий, имеющих пили, желательно также получать антиген, проявляющий меньшую избирательность или вообще

1787165 ее не проявляющий, такой антиген получают путем идентификации и образования одного или более компонентов, которые составляют часть общей пилусовой структуры и которые специально способствуют адгеэии, В тексте такой компонент будет называться пилусовым адгезивным полипептидом. Согласно тому, то говорилось выше. пилусовый адгезивный полипептид включает (в очень незначительном количестве от общей пилусовой аминокислотной последовательности), пили, образованный от дающих пилус патогенных бактерий, который отличен от пилина (субмолекулярная структура очищенного пилуса, образующая основную часть пилусовой нити). Примерами образующих пилус бактерий, используемых для целей данного изобретения, являются уропатогенные и энтеропатогенные штаммы Neisseria gonorrhocae, Nelsserla rnenlngitidis, Neisseria catarrhalis, МогахеИа bovis или другие МогахеИа spp, и

Bordetelia pertussis.

В изобретении в первую очередь использовали уропатогенный штамм Е.соИ, который вызывает пилонефрит, Однако, следует иметь в виду, что другая генетическая система Е,coll, кодирующая пилусовые адгезины, является очень аналогичной первой, Рецептор, ответственный за связыва. ние патогенных образующих пилус бактерий за счет замкнутых структур рецептора — или части рецептора — и молекул адгезина, соответственно, был идентифицирован для уропатогенных бактерий Е,coll как дигалактоэид, звено а — D — Galp — (l 4)

P — D — Galp, присутствующее в глобусариях гликолипидов, к которому могут прилипать бактерии в уроэпителии и которое присутствует также в эритроцитах крови человека как часть антигенов кровяной группы Р, В ходе исследования авторы идентифицировали участок хромосомы уропатогенного штамма Е,соИ, который кодирует Par пили (пили, связанный с пилонефритом), размер которого составляет 8,5 кВ. Этот участок, как было установлено, кодирует по меньшей мере восемь различных полипептидов. Авторы настоящего изобретения определили также те полипептиды, отсутствие которых приводит к неадгезивности (неклейкости) клеток Е.соИ. Предполагается, таким образом, что эти полипептиды ответственны за адгезионный фенотип уропатогенных бактерий Е.соИ. Следовательно настоящее изобретение касается антигена аминокислотной последовательности:

Met уз-1 ys-lie-Arg-Gly-Leu-Cys-Leu-ProVal-Met-Leu-Gly-А! а-Vai- l eu-Met-Ser-Gln5

30 стенки клетки.

20

His-Va1-Hi s-Ala-Val-Asp-As n-Leu-Thr-P heArg-Gly- Lys-Leu-lie-lie-Pro-A1 s-Cys-Thr-ValSer-Asn-Thr-Thr-Val-Asp-Trp- 6! и-Asp-Va1-Gluil e-G ln-Thr-Le u-Se r-61п-As n-G ly-As n-Hl s

Glu-Lys- Glu-Phe-Thr-Val-Asn-Met-Arg-CysPro-Tyr-Азп-Leu-Gly-Thr-Met- Ser-lie-TyrCys-Asp-Va 1-Pro-Va 1-Ser-Va l-Lys-l1e-Ser-LeuLeu-Arg- As n-Thr-Pro-Pro-lie-Tyr-Asn-As пАзп-1.ys-Phe-Ser-Val-Giy-Leu- Gly-Asn-GlyT rp-A s p-S er-l le-l le-S er-1 e u-As p-G ly-V al-G luGin-Ser- Glu-Glu-lie-Leu-Arg-Trp-Туг-Thr-AlaGly-Ser-Lys Thr-Val-lys-Ile- Glu-Ser-Arg-LeuTyr-G ly-Glu-G lu-6 ly-Lys-Arg-Lys-Pro-Gly-G luLeu-Ser-Gly-Ser-Met-Thr-Met-Ча leu-SerPhe-Pro или ее любая иммуногенно активная последовательностьь.

Ранее было установлено, что отсутствие последних двух антигенов является причиной отсутствия связывания с глобозидным рецептором so всех случаях, и таким образом можно полагать, что оба они являются отвечающими требованиям адгеэивных полипептидов, в то время как первый антиген является причиной отсутствия связывания лишь при некоторых обстоятельствах и следовательно он необходим для прочного связывания образующегося адгеэионного полипептида с наружной поверхностью

Следует отметить, что указанные выше аминокислотные последовательности представляют собой формы предшественника пилусовых адгезионных полипептидов, содержащих пептидоподобные последовательности N-концевого сигнала, которые расщепляются, когда полипептид выводится через внутреннюю бактериальную мембрану.

Желательно, что бы анти re н, от веча ющий данному изобретению, был 8 основном свободен от других компонентов, связанных с адгезионной функцией, таких как другие компоненты пилуса тем, чтобы устранялось образование широкой разновидности антител, когда антиген используется для иммунизации с указанными выше недостатками, Предпочтительно, чтобы антиген находился в практически чистом состоянии, то есть был свободен от других детерминант, которые каким-либо образом не связаны с образованием адгезина, ATGAAAAAGATAA6GTTTGTGTCTTCC

GGTAATG CTG G G G6 CAGTGTTAAT6TCTCAGCATGTACATGCAGTTGATA

АТСТGАССТT САGА6GАААACTGATTATTCCTG CCTGTACT6TAAG САА

СА CAACTGTTG ACTG G CAGGATGTAGAGATT CAG AC 6 CTGAGTCAAAAT

1787165

AAG CA6TTGAACAATAAATTTAATGATTTAG

Т А Т Т С А G О G Т Т С Т Т Т Т GСCAGTAGATCTCCCCAAQGGACATTATAAT

ТТТССТОТG АGАТАТАТАСОТООААТАСАОСАССАТТАСТАТОАТСТС .

TG 6 САО ОАТСАТТАТААА55

6 G А А А Т С А С G А А А А А 6 А G TTTACTGTGAATATG CGGTGTCCCTATAATCTGG

G A A C A A T G A A G G T T A СОАТААСООСААСАААСАСТТАТААСААТОСТАТ

ТТТАОТТСАОААТАСА- 5

TCAAACACATCTTCTGATGGGTTACTCGTTTATC

TTTATAACAGTAATG

САООАААТАТТ666АСТОСОАТААСТПАОООА

СТССAТТТАСОСССООAAAAATCACAG6TAATAATGCAGATAAAACTAT 10

А Т С А С Т Т С А Т 6 С C А А АСТГООАТАТС}ААОООААТАТОСАОААТТГОАТА

G CCGGTCCTTTCTCTО СААСАО СААСОСТООТТОСАТСАТАТТС6ТАА, или 15

ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGT

TQ CTTCTQACATCGGTCG СТGTACTGGCTGATGTGCA6ATTAACATCAGG

G 6 Q A A T G T T T A T A T C С С CCCATQCACCATTAATAAC6Q6CACAATATT 20

G T T G T T 6 A T T T T G G G A A TATTAATCCTQAGCACGTQGACAACTCACGT

G GTGAA6 TCACAAAAA С СATAAQ САТАТССТОТССОТАТААОАОТООС

ТСТСТСТООАТААААОТТ- 25

ACGGGAAATACTATQGGAQGAQQTCAGAA

T A A T G T A C T G G C A A C A A A TATAACTCATTTTQQTATAGCGCTGTATCAQ

6 GAAAAG 6AATG ТСАЛ СЛ СCTTATATTAGGTAAT6GTTCAGGAAATQGT 30

Т А C G G A G Т 6 А C A G C A G Q TCTGQACACA6 CACGTTCAACGTTCACCTTT

АCTTCAGTG СССТТТCGTAAT6GСА6CGQGATACTGAATGGCG6G6A

Т Т Т С С А Q А С С А С 6 G С С А G ТА - 35

ТОАО САТОАТТТАТАА СТОА, или

АТОАЛААААТООТТСССТОСТТТТТТАТ

TTTTATCCCTGTCAG6 C6GTAATQATQ CTTTAG CTG GATGG CACAATGT C

АТО ТТТТАТО CTTTTAA С- 40

ОАСТАТТТААСТАСАААТО CTQQTAATGTT

AAG GTTATTGA CGAÀÑ..СТCAG CTATATATA С С СТО ОААТА САО6 СТСТ

G CTACAG CAACTTATTATTCGTQCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGQ 45

А 6ТQТАТТТТСАG ОАО ТАТCT6G CCTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTC

ТАТА CTAATGAG6 6 G TTTААТАТАТТТСТТОАТОТТСАОАО САААТАТ

G 6TT6 6TCTATG6 AGAAT- 50

GAAAATGACAAAQATTTTI ACTl CTTTGTTA

АТО G ТТАТОААТОG GÀÒACATGGACAAATAATGGT6CCCGTAT

TTÑÒÀÒÑ СTGОAAATATGATG CCTTACGATCAGATTAAGCAGCTACCT

G С САСТААТА САТТGАТGTTATCATTCGATAATGTTGGGGGATGCCAG

С С G Т С А А С А С А А G Т А С Т TAATATAGACCATGGGAGTATTGTGATTGAT

CGTG СТААCGGAAATATT6CAAGTCAGACGCTTTCAATTTATTGCGAT

GTACCAGTTAGTGTAAAATATCTCTG CTCAGAAATACACCACCAATA

ТА CAATAATAATAAATTTTCGGTTGGGTTAGGTAATGG CTGGGATTCG

АТААТАТСТ СТTGАТG GÎGTTQAACAGAGTGAGGAAATATTACGCTGG

ТАСА CAG С CGG CTCAAAAACAGTAAAGATTGAGAG CAGGTTGTATGGT

6 А А G А G G 6 А А А G А G А А А ACCCGGGGAG CTATCTTGGTTCTATGACTAG

ТОТТСТ6АОТТТСС ССТОА

Согласно заявленному способу, нуклеотидная последовательность, кодирующая антиген, как указано выше, сливается с нук- леотидной последовательностью, кодирующей физиологически пригодный носитель полипетид, слившаяся последовательность

ДНК вводится в соответствующий вектор, гибридный вектор транформируется в соответствующего бактериального хозяина, этот хозяин выращивается в соответствующей среде, и слитый пли полипептид извлекается из культуры и при желании очищается, Содержащийся в описанной конструкции фрагмент ДНК может быть последовательностью ДНК или частью последовательности ДНК, кодирующей пилусовый адгезивный полипептид, который получен от патогенных образующих пилус бактерий, таких как уропатогенные или знтеропатогенные штаммы Escherlchia coll, Nelsseria gonorrhocae, Neisserla

meningitidis, Neisserla catarrhalls, МогахеИа

bovls или другие Moraxella spp. или

Bordetella pertussis, Примером такого фрагмента ДНК может быть фрагмент, который полностью или частично включает последовательность ДНК, кодирующую один или более адгезивный полипептид от уропатогенного штамма

E.coli. Следовательно, настоящее изобретение касается фрагмента ДНК, который как основной элемент состоит из последовательности ДНК или любой его последовательности, которая после ее выражения составляет иммуногенно активную последовательность адгезионного полипептида, кодированного одной из последовательностей

ДНК.

Важным аспектом данного изобретения является способ получения антигена, включающего в качестве его основного иммунизирующего компонента детерминанту

1787165

10 адгезивного полипептида, в котором осуществляют выращивание бактериального хозяина, заключающего в себе гибридный .вектор, содержащий введенный фрагмент .ДН К, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген, и этот фрагмент ДНК не кодирует никакого другого антигена, и данный продукт извлекается и при желании далее подвергается очистке.

Хромосомная ДН К от образующей адгеэивный полипептид бактерии отделяется посредством ограничительной эндонуклеазы, и отдельные фрагменты ДНК вводятся в соответствующий вектор, которые затем трансформируются в соответствующих бактериальных хозяев. Затем трансформированные бактерии исследуют в отношении их адгезивной функции путем определения их способности связываться с любой твердой поверхностью, включающей специфический рецептор, например путем испытания на склеивание с эритроцитами, стандартными методами. Фрагменты ДНК от клонов, которые сохранили адгеэивную функцию, затем субклонируют в соответствующий вектор и подвергают транспозонному мутагенезу и/или частичной обработке рестриктазой и религации, далее определяют субклоны, которые содержат наименьшие фрагменты ДНК, кодирующие адгеэионную функцию в бактериальном хозяине. Таким образом, получают наименьшую последовательность оперона, которая выражает адгезионную функцию поверхности клетки.

Манипуляции либо транспозонным мутагенезом, либо делецией используют для идентификации отдельных генов в пределах оперона, которые сохраняют или не сохраняют способность выражать адгеэивный полипептид, Ген или гены, выражающие адгезивный полипептид, затем вводятся в соответствующий вектор с вводом соответствующих промоторов для усиления выражения адгезионного полипептида или полипептидов, Затем этот вектор трансформируется в соответствующий организм хозяина такой как бактерии, например грамм-отрицательные бактерии, такие как

Е,соИ или B.subtilis.

Возможно также избирательное блокирование или удаление генов в случае Е,соИ papA и рарС генов, что не сказывается на экспрессии адгеэивного полипептида.

Поскольку очистка классическими химическими способами пилусового адгеэивного полипептида из препарата, в котором он присутствует в виде смеси с основным пилусовым структурным компонентом, черезвычайно затруднительна и даже бывает совершенно невозможна ввиду того, что

35 .рецептора

45

5

20 структурный компонент, который является иммуногенным KGK таковой, присутствует в значительно большем количестве, то данный метод рекомбинантной ДНК для получения второстепенного пилусового адгезивного полипептида имеет принципиальное значение для получения иммуногенно эффективного и достаточно чистого антигена согласно данному изобретению, поскольку метод рекомбинантной ДНК позволяет осуществлять избирательное удаление генов, кодирующих нежелательные антигены, или выраженный другим образом, он позволяет осуществлять отбор гена или генов, кодирующих желательные второстепенные адгезивные полипептиды. В результате клонирования данного гена или данных генов в соответствующие векторы, как описано выше, можно получить большие количества второстепенных пилусовых адгезивных полипептидов, которые в противных случаях присутствуют лишь в иммуногенно неэффективных ничтожно малых пропорциях в уже известных пилусовых препаратах, Согласно изобретению несколько генов, кодирующих один или несколько желаемых адгезивных полипептидов, могут быть клонированы в один и тот же вектор, так что продукт, образованный данным микроорганизмом, будет представлять собой продукт с периодически повторяющимся детерминантами данного антигена, способствующими усилению эффективности связывания

Все эти операции осуществляют способами; хорошо известными для приемов рекомбинантной ДН К.

Вектор, используемый при осуществлении данного способа, может представлять собой любой вектор, обычно применяемый, например, для таких производных как pBR

322, векторы с промотором Lac UV5, векторы широкого круга хозяев, такие как векторы с промотором tac. челночные векторы

Питательная среда в которой выращивается бактериальный хозяин, может быть любой питательной средой, обычно используемой для процессов ферментации, например Lпитательным бульоном или средой М9-глицерина. Бактериальный хозяин обычно выбирается из числа хозяев, поведение которых уже известно в условиях ферментации таких как Escherichia соИ или Bacillus

s ubtili s.

После очистки второй полипептид может быть отщеплен от сигнального пептида с помощью протеазы, такой как трипсин или химотропсин. Желаемые фрагменты, образованные лишь от фрагмента ДНК, кодиру1787165

12 ющего первый полипептид, с которым использованием фрагмента Кленова в бусливается ген, кодирующий второй пол- фер, в который добавляют200 мкмол каждоипептид, отбираются по принципу их им- ro требуемого dNTPs. Связывающее звено муногенной активности, например, при Xhol/5 — CCTCGAGG-3 / и связывающее испытании вусловиях "In vitro". 5 звено BamHI/5 — CGGAT CCG — 3/ получают

Отделение этих двух полипептидов из "Collaboratite Research" и 5 -фосфорилиможет осуществляться стандартными мето- рованные препараты получают с испольэодами, такими как ионообменная хрома- ванием полинуклеотидной киназы из. Нью тография, жидкостная хроматография Инглзнд Биолэб. Все химические препаравысокого давления или хроматография 10 ты имеют максимальную степень чистоты. сродства, например, хроматография имму- Очистка пили. нологического сродства или рецепторного Клетки выращивают в течение 22 ч при сродства. В случае хроматографии иммуно- . температуре37 Снапятилотках(400х250мм), логического сродства любые антитела, дей- содержащих,L-агар без глюкозы. Клетки .ствующие против антигенов согласно 15 удаляют с лотков, суспендируют в 340 мл данномуиэобретению(включающих первый охлажденного льдом 5 ммоль Трис-HCI полипептид), или антитела, действующие (рН. 8) и перемешивают в течение 10 мин на против второго полипептида, могут исполь- льду в смесителе. После зернения (гранулязоваться как антитела, иммобилизованные ции) клеток и продуктов распада (двукратв колонке. В хроматографии рецепторного 20 ное в течение по 30 мин при 20000 х g) во сродства. может аналогичным образом ис- всплывший слой вводятсульфатаммониядо пользоваться рецепторполучаемогоадгези- степени насыщения 55% и пили осаждают на. Фрагмент ДНК, используемый для, на льду в течение ночи, Осадок извлекают слияния с последовательностью ДНК, кади- . путем центрифугирования и снова суспенрующей второй полипептид, может быть лю- 25 дируют в 5 ммоль Трис (рН 8). После диализа бым указанным выше фрагментом ДНК. в течение ночи с использованием того же

Способ получения антигена, адгезив- буфера при 4 С, нерастворенный продукт ный полипептид, такой как пилусовый адге- удаляют путем центрифугирования в течезивный полипептид или его иммуногенно ние 30 мин при числе оборотов центрифуги активное вещество, может быть получен пу- 30 40 000 х g, Процедуру осаждения — диалиэ тем синтеза пептида согласно хорошо изве- повторяют еще 3 раза (осаждение в течение стным способам, таким как жидкофаэный 3 ч}, после чего пили осаждают путем добавсинтез пептида или твердофазный синтез ления 0,2 обьемов 1 моль MgCI2 1,5 моль пептида. NaCl — 100 ммоль Трис-HCI (рН 7,5). Осадок

В твердофазном синтезе аминокислот- 35 растворяют до получения концентрации ная последовательность создается путем белка 2 мг/мл, Выход составляет примерно связывания исходной аминокислоты с носи- 15 мгдля беспорядочного типа и 2 — 30 мг для телем и последующего ввода других амино- мутантов. кислот в данную последовательность путем Анализ на связывание рецептора. пептидногосвязывания, вданномслучаедо 40 Для определения агглютинации на длины цепи не менее пяти аминокислот. предметном стекле бактериальные клетки, При получении адгезивного полипептида выращенные в течение 22 ч на не содержаили его последовательности методом твер- щем глюкозы L-агаре, суспендируют до дофазного синтеза пептида желательно, та- примерно 10 клеток/мл в клейком буфере— кимобразом,использоватьфизиологически 45 150 ммоль NaCI, 10 ммоль Трис-HCI, (рН = пригодный полимер, который может ис- 7,5), содержащем 3% гепаринизированных пользоваться в качестве носителя для анти- и промытых зритроцитов человека, Реакгена в вакцине, в качестве носителя, с ция, в случае если она положительна, обычкоторым связывается исходная аминокис- Но протекает в течение в пределах 60 с. В лота в данной последовательности. 50 случае положительной реакции скопления

Изобретение иллюстрируется следую- зритроцитов были макроскопически видищими примерами. мыми. В полуколичественном анализе клетПример 1, Общие материалы и мето- ки, выращенные как указано выше, снова ды. суспендируют до Ако- оо. Затем их последоХимические препараты и ферменты. 55 вательно двукратно разбавляют в 50 мкл, Ограничительные ферменты и лигазу Т4 агглютинирующего буфера с использованиДНК получают от "Boehringer Mannheim ем микротитровальных чашек с приемни6МВНилийеиЕпо!апб Biolab",èиспользу- ком. К ним добавляют 10 мкл 3%-ной ют по рекомендации изготовителей. По- суспензии эритроцитов в том же буферном полнение з концов осуществлялось с растворе. Разбавленный. раствор в послед13

1787165

55 нем приемнике, где наблюдалась положительная эгглютинация по прошествии 2 ч при 4"С, был взят как титр агглютинации.

Число клеток исходной суспензии используют совместно с титром для.расчета минимальной концентрации бактерий, требуемой для эгглютинации.

Титр агглютинации очищенных пили определяют в основном таким же образом, как для всех клеток в целамОднако, при использовании: агглютириующего, буферйого раствора концентрация пилус, необходимая для агглютинации, была очень высокой и были сделаны попытки увеличить чувствительность анализируемой пробы. Поскольку пили имеют отрицательный заряд при физиологической величине рМ и скапливаются в присутствии 167 ммоль MgCI2, пилусовый препарат беспорядочного .типа титровали при повышенных концентрациях MgCI, используя Р-эритроциты, содержащие глобозидный рецептор (включая дигалактозид) и р-эритроциты, в которых отсутствует данный углевод, Обнаруживают, что титр агглютинации увеличивается в 128 раз при увеличении концентрации MgCI до 100 ммол ь.

Это сопровождается параллельным уве. личением Aqpp составляющем 200 мкг/мл раствора пилуса в тех же буферных растворах. При использовании СаС1г и 10-кратном . увеличении концентраций NHке результаты, позволяющие утверждать что оказывается влияние на взаимодействие пилус-пилус, а не на связывание специфического рецептора, Кроме того, на титр агглютинации вСех пилитированных клеток незначительно влияет введение Mg CIg вплоть до концентрации 200 MMoR b.

Наряду с этим увеличение титра агглютинацил с использованием р-эритроцитов показывает, что скоплению неспецифических пилус-эритроцитов благоприятствует введение ионов Mg хотя на специфичность г+ анализа (P-титр на р-титр) это не оказывает влияния. Таким. образом, все титрования пилусовых препаратов, осуществляемые в агглютинирующем буферном растворе с использованием 100 ммоль MgCIy, дают полуколичественные данные для специфи. ческой агглютинации.

Получение антитела.

Преимунную сыворотку получают от двух здоровых весом по 1,8 кг самок Новозеландских белых кроликов путем сердечной пункции, подвергают стерилизации о фильтрованием и выдерживают при — 20 С, 75 мкг очищенного Рар пили в 10 мл изотонического солевого раствора эмульгируют равным обьемом полного стимулятора. Freund s и вводят в количествах 0,5 мл в четыре точки, а именно — в двух точках подкапиллярно и в две задние лапы подмышечно, Спустя шесть недель дают повышенную

5 иньекцию полного стимулятора Freund s.

Через десять дней после этой второй иммунизации осуществляют кровопускание у животных путем сердечной пункции, и данная сыворотка подвергается стерилизации

10 фильтрованием ВМрсТе с 0,02% азидом на.трия при -20 С.

Анализ пилусового антигена.

Для агглютинации на предметном стекле бактерии выращивают и подготавливают, 15 как описано для проб гемагглютинации, Анализы агглютинэции всех клеток в целом осуществляют с 500-кратным разбавлением (PBS, рН 7,5) антисыворотки, действующей против Рар пили (смотри выше). Положи20 тельную реакцию определяют кэк макроско- пически видимое скопление бактерий, которое обнару>кивалось в течение в пределах 600 с.

Выражение белка в миниклетках, 25 Плазмида рРАР5 и ее. производные трансформировались в штамм Р678-54, Радиоактивные образцы подвергают электрофорезу в SDS полиакриламиде (смотри ниже), Данные. гели затем закрепляют, ок30 рашивают и усиливают и подвергают ауто радио графическому исследова н ию.

Осуществляют параллельный электрофорез продуктов со стандартными молекулярны, ми весами и очищенного пилина.

35 Гель-электрофорез в SDS — полиакрилэмиде (SDS — додецилсул ьфат натрия).

Радиоактивные образцы суспендируют в 100 мкл взятом для пробного анализа буферном растворе, содержащем 62,5 мк моль

40 Трис-HCI (рН 6,8), 1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5%-P-меркаптоэтанола и 10% глицерина. После кипения в течение пяти минут экстракты подвергают электрофорезу в 15%-ных полиакриламидных вязких гелях, содержащих 0,1%, SDS. Одновременно анализируют белковые стандарты с молекулярными весами в пределах от 3000 до 94000.

После закрепления, скрашивания и обесцвечивания, гел ь подвергают флюорографии.

Клеточные экстракты, Клетки штамма Р678-54 с содержанием различных гибридных плазмид выращивают на триптиновом соевом агаре в присутствии соответствующих антибиотиков, Бактерии собирают после выращивания в течение ночи пои 37 С, суспензируют в PBS (рН 7,2)

Brij — 35до достижения плотности клеток, соответствующей 1,5 единиц поглощения света при 560 нм, и извлекают путем центрифугирования (со скоростью вращения

1787165 центрифуги 12000 g в течение 10 мин). Клеточную гранулу затем суспендируют в 400 мкл 1%-го Nonidet Р-40 — 1% натрийдиоксихолята — 0,1% SOS — 0,15 моль NaCI — 0,01 моль Трис-HCI (рН 7,2), содержащем лизо- 5 цим концентрацией 1 мг/мл, и инкубируют в течение 10 мин при 4 С. 400 мкл пробы антисыворотки Рар с разбавлением

1/15000 вводят в данный клеточный экстракт, После инкубации при 4 С в течение 10

16 ч смесь антител клеточного экстракта очищают путем центрифугирования (12000 x g в течение 10 мин).

Анализ с конкурентным связанным ферментом иммуносорбентом, 15

Микротитровальные чашки гемагглютинации подвергают воздействию 100 мкл раствора, очищенного Рар пили концентрацией 1 мкг/мл в 0,1 моль буферном растворе карбоната натрия (рН 9 6) в течение 16 ч при 20

25 С. Приемники промывают три раза 015 моль NaCI, содержащим 0,05% (об/об) Brij

35 (Сигма) с целью удаления несвязанного пили, Анти-Рар пилусовую антисыворотку кролика разбавляют в pBS (pH 7,2), 0,05% 25 ной (об/об) ВгЦ вЂ” 35 до концентрации, приводящей в результате к 50%-ному максимальному связыванию (разбавление

1/30000), и затем смешивают с последовательно разбавленными растворами в 30

pBS — Brij лизатах бактерий, свободных от клеток экстрактов, или Рар пили (положительный контроль), или без вводимых пили (отрицательный контроль). После инкубации в течение 16 ч при 4 С 100 мкл образцов 35 переносят в сенсибилизированные приемники титровальных чашек. Эти чашки инкубируют в течение трех часов при 37 С и затем трехкратно промывают NaCI — Brij ®.

Во все приемники титровальных чашек вво- 40 дят соединенный с щелочной фосфатазой противокроликовый иммуноглобулин 6 коз, разбавленный до 1/1000 в PBS Brij®, и их инкубируют в течение одного часа при 37 С.

Чашки промывают 3 раза pBS —.Brij® и в 45 каждый приемник чашек вводят 1 мг паранитрофенилфосфата на миллилитр в 1 моль диэтаноламинового буферного раствора (рН 9,9) и осуществляют инкубацию в течение 20 мин при 37ОС. Реакцию прекращают 50 при вводе 2н NaQH и определяют поглощение света при 405 нм с помощью ауторегистрирующего устройства MR 580 Микро

Е 1.1$А.

Построение плазмидных производных. 55

Фрагмент EcoRI-BamHI длиной 9,6 кв от PR НИЗО, содержащий все необходимые гены для выражения Рар пили и специфического связывания дигалактозиды, клонируют в pBR322. Вектор представляет собой

pBR322, обработанный рестриктазой Pvu II и лигированный с 20-кратным избытком связывающего звена Barn Hl. Данную ДНК последовательно обрабатывают фрагментами

EcoRI и BamHI, и самый большой фрагмент, несущий нуклеотиды 2065-4360 плазмиды

pBR 322, выделяют из 0,7%-ного агарозного геля. Этот фрагмент, сшитый с

EcoRI-BamHi фрагментом рВНИЗО, трансформируют штаммом Е.coli НВ101. Изолированный клон кодируют рРАР22 и он идентичен рРАР5, с той разницей, что в этом клоне отсутствует сегмент BamHI — Pvu I!.

Производное рРАР23, несущее смещенную рамку считывания в единственной точке Pvu

II s рар Л, построено путем гидролиза рРАР22 с помощью Pvu II и лигирования с

20-кратным избытком связывающего звена

Xhol. После обработки полученной конструкции в течение трех часов с использованием 20 единиц Xhol/ìêã ДНК данный фрагмент очищают на колонке с введением

10 ммоль Трис-HCI (рН 8) и 1 мМол ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). После привязывания и трансформации в штамм E.соП HB 101 ДНК от шести клонов извлекают, анализируют, Пять таких клонов имеют новый сайт рестрикции Xhol вместо сайта Pvull и один из них называют р РАР23 и используют в последующих исследованиях. Плазмиду рРАР 1 конструируют путем гидролиза 2 мкг р BR322 с Clal и тупые концы получают с использованием 5 звеньев фрагмента Кленова и 200 мкМол каждого из dGTP u dCTP (15 мин при 30 С в связывающем буферном растворе). Эту ДНК после инактивации нагреванием данного фермента лигируют с очищенным фрагментом

SmaI< — Smalz от рРАР5 и выделяют плазмиду, несущую данный фрагмент в такой ее ориентации относительно вектора, как и рРАР5 Клон рРАР1 выражает полипептид размером 35 кб, Таким образом ген для данного полипептида простирается за пределы точки Smalz и присутствует в срезанной форме в р РАР1. Данную мутацию выделяют из фрагмента Kpn1-.BamHI, который лигируют с отрезком р РАР5 этими ферментами.

Данное производное рРАР7 содержит фрагмент рар ДНК вплоть до точки Smaiz. Плазмиду рРАР9, содержащую всю зону

SmaI1-BamH<, строят путем фрагмента

Крп1 — BamHI плазмиды рРАР5 в избыточном количестве с Kpnl — BamHI фрагментом плазмиды рРАР1. Для получения мутаций типа сдвига рамки считывая во вставке р

РАР9, данную плазмиду частично гидролизуют с Hincll в присутствии 150 мкг/мл этидийбромида. Гидролизованную плазмиду затем извлекают из 0.70%-го агарозного ге1787165 ля и привязывают к избытку звеньев Xhol.

После вываривауия Xhol, хроматографии на геле Siphadex ДНК трансформируют в щтамм Е,соИ НВ101 с отбором по стойкости к ампициллину. ДНК, очищенную.от 23 клонов, анализируют путем гидролиза с Xhol u

$аИ.

Производные рРАР5, несущие эти мутации, конструируют аналогично рРАР7.

Эти плазмиды носят название рРАР15 (Hlncll 1) и рРАР14 (Hlnclla). рРАР19 конструируют путем делеции фрагмента Xhol-Sall из плазмиды рРАР14 путем сшивки с фрагментом Xhol-$аИ последней плазмиды. По.строение рРАР20 от рРАР 15 осуществляют аналогичным образом. Для полученйя плазмиды р РАР 26 /papAl, papEI двойного мутанта/ большой фрагмент Kpnl-Bam Н! рРАР23 /papAI/ привязывают к небольшому фрагменту Kpnl-BamH! от рРАР10

/papEl/. Плазмида рРАР9 не включает вставок Тп5 в пределах зоны Smal> — ВатН!. Следовательно, фрагмент EcoRI, содержащий промотор lacUV5, выделяют из PSK 106 и привязывают с избыточным количеством

:. обработанной рестриктазой EcoRI плазмидой рРАР9. Клон с данным фрагментом находится в правильной ориентации и таким образом рРАР 16 извлекают путем отбора препаратов с ДНК, гидролизованной Pstl, поскольку данный фрагмент промотора несет асимметрично расположенную точку данного фрагмента. Ту же процедуру используют для других производных рРАР9 даЮщих в результате рРАР4 (Smalz-Bam Hl делеция), рРАР18 (Н!пс!! мутация) и рРАР17 /Н!псИ2 мутация/, П р и .м е р 2. Высокомолекулярную хромосомную ДНК из ас-уропатогенного изолята извлекают согласно стандартным методам. Эту ДНК затем обрабатывают эндонуклеазой Sau 3 А.Sau ЗА линкеры пришивают. к плазмидному вектору рНС79, который предварительно гидролизуют эндонуклеазой BamHI. Эту ДНК в условиях "!и

vitro." вводят в частицы Л.фага.. Эти частицы используют для заражения штамма E.coll

Р678-54. Затем данные бактерии распределяют по пластинам, содержащим ампициллин, что приводит к образованию колоний, содержащих рекомбинантную плазмиду, которая стойка к ампициллину, Индивидуальные колонии отбирают для агглютинэции эритроцитов человека в присутствии 1 $ мэннозы. В результате был отобран клон /рРН 807/, вызывающий стойкую к маннозе гемагглютинацию. Субклоны

pRHI430 и pRHI 845 конструируют с сохранением MRHA для анализа пробы.

В результате введения в периферическую часть рарДН К устраняется гемагглютинация, что позволяет образовываться Рар пил:и.;

Далее фрагмент Small-BamHI субклонируют в pBR322. Поскольку полученная плазмида не дополняет вставки Тп5 в зону

Small — BamHl, то клонированный фрагмент находится под транскрипционным контроровать требуемую трэйСкрипцию, генов на данном фрагменте), который вводят в плазмиду как фрагмент EcoRI, являющийся производным от pSK 106. Такую структуру

15 рРАР16дополняютчетырьмя негемэгглютинирующимися мутантами Тп5 с точками вставки в фрагменте Smal1 — BamHl. Строят производные данных мутантов со сдвигом рамки считывания от рРАР5, содержащих повреждения в данной зоне. Обе мутантные плазмйды рРАР14 и рРАР15 несут линкеры

Xho1 в точках Hinciiz и Н!псИ соответственно. В третьем мутанте рРАР7 удаляют рар

ДНК от Smaiz до BamHI, Полипептиды, экспрессирующиеся с рРАР5. и его трех мутантных произвОдных, подвергают мечению (з5Яметионином в миниклетках E,coli и полученные полипептиды анализируют íà SDSполиакриламидном геле, При сравнении с

30 рРАР 5 плазмида рРАР 7 экепрессирует полипептид 35 кг!. Вместо этого экспрессировался полипептид 34 кг!, . Получают миниклетки от мутанта Н!сИ! рРАР15, что не приводит к образованию полипептида 16,5 кб. Ген для данного полипептида заканчивается рар е и мутация со сдвигом рамки считывания рассматривается как рэрЕ!. Эффекты полярности, вызванные вставками Тп5 в рарЕ и papF на papG, показывают, что транскрипция всех трех генов происходит в данном направлении.

Для подтверждения положения мутаций Тп5, относящихся к генам рарС, Тп5 мутации 002, 021, 026 и 042 дополняют му45 тированной зоной Smai<-BamHI. Строят производные papEI, papFI u papGI от рРАР16, несущей зону Smai< Вап1Н! под контролем промотооа lacUV5. Затем их трансформируют в штамм Е,.соИ НВ 101, не50 сущий производные Тп5 от рРНИ 746, и анализируют на глюкозидо-специфическую гемагглютинацию с использованием Р>- и р-эритроцитов. Производное papEI дополняет все мутации Тп5, как родственная плаз55 мида рРАР16. Плэзмидэ рарЕ! дополняет

Тп5 мутации 026 и 042, а.плазмида, несущая

papGl, дополняет мутации 002 и 021. Это определяет вставки 002 и 021 Тп5 как мутации в papF, и показывает, что Тп5 вставки

026 и 042 сохраняются в papG гене.

10 лем промоторэ lac UV5 (так чтобы гаранти1787165

Как указывалось выше, Тп5 вставки в ми EcoRI и BamHI, подвергают препаративpapF u papG полностью исключают агглю- ному гель-электрофорезу на агарозе для вытийацию, хотя образуются пили. Дпя апре- деления фрагмента EcoRI-BamHI, деления в каждом случае значЕния содержащего зону Smai1-ВащН1, гемаrãëþòèíàöèèрарЕ, papFи papG генных 5 Аликвотыэтогофрагмента гидрализуют продуктов осуществляют аналйз на гемагг- . с эндонуклеазами.Нае1И, Rsal, Alul, Нра ll; лютинацию неполярных мутантных произ- ЗаК ЗА, Tag I, Hfnc И и Bgl II отдельно или в

".водных вставки связывающего:звена от, комбинации. Полученные фрагменты клони рР Р5. Было найдена, что ни papFM- ни руют лйбо непосредственно в ходе, либр рар6И производное непокаэываетникакой 10 после препаративного гельэлек ф льэлектро рореза агглютинации Р-эрйтроцитав, демонстри-: на агарозе, и выделение фрагмента осущеруя тем самым, что как papF, так и papG ствпяют в векторы фага М13 (M13mp8 и геннь|е продукты. необходимы для агглюти- M13mp9). Эти вставки вводят в последованации, Мутант рарЕ! сам по себе не оказы- тельном порядке да тех пор, пока для обеих вает влияния на титр гемагглютинации, но 15 ниток не получают однозначные, частично двойной мутант рРАР26 не агпютинирует совпадающие показания последовательноР - эрйтроциты, когда трансформируется в сти ДНК фрагмента Smal-BamHl. штамм Е.со11НВ101; .. Пример 4. Гены papE, papF и рарС

Образование пилусовога антигена и ха- идентифицируют из известного положения рактеристики дигалактозидо-специфиче-. 20 генов, определяемых посредством линкеского связывания различных производных . ров и вставок ТпБтранспазона и известного мутантов рРАР5 или рРАР22 в штамме E,coli размера их соответствующих генных проНВ101 суммированы в табл, 1.. дуктов, 16,5 кб 15 кс1 и 35 кб. ИдентифициПлазмиды PSN представляют собой руют N-концы этих генов. Аминокислотную .производные pACYC184„несущие фрагмен- 25 последовательность получают от паследоты EcoRI от рВНЦ 845, каждая плаэмида ватепьностиДНКсиспользованиемгенетисодержит различные вставки Тп5, в то время ческого кода, установленного для Е.со11. как рРАР плазмиды являются производны- Поскольку все генные продукты получают . ми от р ВВ322. Пилусовый антиген опреде- предшественники, содержащие сигнальные ляют путем агглютинации на предметном 30 пептиды, то можно считать, что 5 -конец стекле клеточной суепензии с антисыворот- " гена является метионином с после ю и следующеи кой, действующей против Рар пили. ..сигнальной пептидоподобной последоваИз табл.1 видно. что мутация papAl в тельнастью. рРАР23 полностью устраняет образование П р.и м е р 5. Гомология с ДНК другой основного Рар пилусового субзвена (PapA 35 уропатагенной Е.со11. . генный продукт) без влияния на дигапакта-. Выделяют некоторые фрагменты от о3 доспецифическое связывание. И наобо- ны Sma11-BamHI и подвергают их P-мечеи ь от зорот, мутация papFl в рРАР14 и.papGI в нию посредством ник трансл

Р Р р нсляции. р А 7 устраняет дигалактозидоспецифиче- Фрагменты отбирают таким образом, чтобй ское связывание без предотвращения абра- 40 охватить всю зону в небольших сегментах. зования Рар пили. Мутация в генах рарС и Ихиспопьзуюткакпробы при гибридизации рарД устраняет как образование пипуса, так плазмид рДС5 и pPIL 110-35 в строго конти дигалактозидоспецифическое связыва- ролируемых условиях. От генов рарЕ и papF ние. Лишь мутации в papF и рарС приводят получают сильйые сигналы гибридизации, в к устранению дигалактозидоспецифическо- 45 та время как от зоны гена рарС не было га связывания без. препятствия образова- получено никаких сигналов. Сильную гибринию Рар пили. Единственным исключением дизацйю в Строго контролируемых условиях является двойной мутант papAI-рар Ef, като- получают также от пробы гена рарС между рый отрицателен для агглютинации. Лишь точками Hnal примерно при 3,2-3,4 кв от мутации в рарА или рарЕ являются скрепля- 50 точки EcoRI. ющими. Этот эффект обусловлен тем факто- Строят рестриктные ограничительные ром, чта полипептиды рар А или .papF карты РДС5 и pPIL 110-35 и отмечают. что являются предположительно такими, кото- они почти идентичны ограничительной каррые требуются дпя склеивания адгезина со те РРАРБ в отношении зон рарС и рарД. стенкой клетки. Отсюда можно сделать вы- 55 Меньшая, хотя и давольно высокая степень вад, чта гены papF и/или рарС.кодируют сходства наблюдалась дпя генов рарЕ и

:дигалактозидоспецифическую адгезию. papF, Ввиду этого делают вывод, что ДНК, Пример 3. Определение ДНК после- которая кодирует РНА в других уропатогендовательности ДНК пилусоваго адгезина ных штамма E.åoll, очень близка ДНК, кло100 мкг рРАР9 обрабатывают рестрактаза- нированной в рРАР5 (образованной от

1787165

У штамма Е.coll J 96), и этот результат, полученный для системы Рар, может относиться. к большинству пилонефритогенных штаммов. В отношении рР1 110-35 также было продемонстрировано, что мРНА является дигалактозидоспецифическим. Анало-. гичные результаты получают с хромосомной

ДНК от клинических изолятов, выделенных авторами данного изобретения, а также другими исследователями.

Слияние между геном рарС и геном Lac2

Плазмиду рРАР9 обрабатывают с Bgl ll и Sal, расположеннымй на расстоянии примерно 375 Ьр вправо от точки Barn Н! и рРАР9; Полученный фрагмент связывают с плазмидой рМС874, который предваритель но гидролиэуют с Bam Hl и Sall, После трансформации в рМС1061 и.посева на пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллин.а, рек омбийанты анализируют. Была выделена плазмида pHMG51, состоящая из рРАР9; в которой фрагмент Bgl И 1-$аП замещают-+отрМС874(фрагмент ВатН!и Sall), показывают, что она кодирует пептид слияния рарС-Lac Z. Этот результат был получен также из известной последовательности гена рарС и последовательности гена lacZ, присутствующего в ðÌÑ875.

Пример 6. В другом возможном способе, являющемся вариантом способа

N-концевые фрагменты ДНК, включающие ген pPF, получают путем гидролизэ рРАР9 с

Bglll. Эту ДНК йнкубируют в течение увеличивающихся периодов времени вместе с зн-, донуклеазой ЕхоП1, затем обрабатывают нуклеазой Sl, что прйводит в результате к увеличивающимся делециям из точки Bgl П.

Подсоединяют линкеры Hound ill. Эту ДНК затем повторно гидролиэуют Smal u Hind !И и подвергают препаративному гель-электрофорезу йа агарозе. Фрагменты длиной в пределах от 1400 до 1000 Ьр выделяют и привязывают к соответствующему вектору, который предварительно гидролизуют с

Sma! и Hind!П.

Построение фрагментов, содержащих ген рарС, осуществляют методом, описанным выше, но путем гидролиза с Bam Hl вместо Bgl П. Отбирают фрагменты длиной от 2400 до 1500 Ьр на гель. Построение фрагментов, содержащих ген рарЕ, осуществляют таким же образом с отбором фрагментов в пределах от 800 до 400 Ьр.

Фрагменты ДНК, кодирующие N-концевую часть гена papF, клонируют в вектор слияния, такой как pSKS 10, pSKS 105 или

pSKS 106, получают гены слияния с геном

lacZ, Слившийся ген (ген слияния в этих структурах) транскрибируют промотором

lac UV5.

Данную структуру трансформируют в штамм, содержащий ген lacq, например штамм Е.соП ЛМ103, отбираемый для стойкости к ампициллину. Затем этот штамм вы5 ращивают в подходящей среде, такой как LB бульон, до оптической плотности ОД = 0,4.

Транскрипцию слившегося гена индуцируют путем ввода! РТ6. Инкубацию продолжают, пока не получается максимальное

10 выра>кение слившегося генного продукта.

Данные клетки затем собирают и слившийся генный продукт очищают.стандартйыми методами, с использованием анализа на активность|9-галактозидазы. Этот очищенный

15 продукт слияния используют в испытаниях вакцины, например, на грызунах, обезьянах, свиньях.

В. Приготовление вакцины.

Любые генные продукты papF, или papG

20 или их соответствующие фрагменты получают следующим образом.

Очищенные белки слияния гена lacZ u генов papE, papF или papG гидролизуют протеэзой, например с трипсином или хи25 мотрипсином, или химическим реагентом, таким как бромистый цианоген или гидроксиламин, Пептид получают из образуемой пептидной смеси стандартными методами, например методом ионообменной хрома30 тографии или жидкостной хроматографии высокого давления с обратимыми фазами, Согласно другому возможному способу антитела, действующие против белков слияния, усиливают свое действие при иньек-.

35 ции их в организм кроликов, Полученные в результате антитела могут использоваться для очистки неслившихся чистых генных продуктов papE, papF, или papG от бактерий

lacZ, содержащих плазмиду, несущую зти

40 гены. Эта плазмида может быть производной pBR 22, такой кэк рРАР5, или рРАР16, или производной быстроудаляемой плазмиды, например рВЕИ28.

Очистку осуществляют методом гель45 хроматографии и иммуносродства или ее антитело используется для анализа ELlSA, которое используется для обнаружения полипептидов, когда ведется протокол очистки, Фрагменты этих очищенных полипепти50 дов получают путем расщепления протеазой или другими агентами, как описывалось выше.

Фрагменты, состоящие иэ 5-30 аминокислот или более генных продуктов papEÄ

55 papF или papG, синтезируют путем твердофазного синтеза пептидов. Затем их могут использовать для вакцинации как таковые или в сочетании с молекулой носителя или с физиологически пригодным носителем, таким как поли L-лизин или поли 0,L-аланин, 1787165

24 как со стимулятором, так и без стимулято- ных полипептидов из других склеивающихра.: . ...: -: . ся бактерий, таких как Nelsseria зр. и др.

С, Система псевдомонас. В принципе, все исследования могут

Предположив, что образование пилуса осуществляться с использованием химии и адгезия связаны в видах Pseudomonas, 5 белков. Данные адгезйвные полипептиды хромосомную .ДНК от склеивающегося: могут быть обогащены (очищены рецептоштамма. Pseudomonas обрабатывают эндо- ром, Например дисалактозидом, хроматогнуклеазой, в результате чего получают фраг- рафией сродства: или каким-либо. другим менты, которые клонируют в производную:.,подходящим методом (таким как хроматогрВЯ322, челночный вектор Pseudomonas 10 рафия сродства антитела). Чистота белка

Е:,соИ, плазмидный вектор или.фаговый век- может быть определена методрм гель-злек-. тор, и трансформируют в Е.coll. Бактерии трофореза полиакриламида,-как описано в заключающие в себе гибридный вектор, от- разделе Материалы и методы, бирают для получения основного субэвена Пример 7. Материалы и методы, Pseudomonas пили с использованием анти- 15 используемые в данном примере, тел, действующих против очищенного Бактериальные штаммы, плазмиды и усРзецбоаойаз пили.. ;ловия роста.

Полученный клон затем используют для,. Все бактериальные штаммы представполучения последовательности ДНК, содер- ляют собой. производные E.coll, К 12, за жащей пилийовый ген. Данный фрагмент 20 исключением клинических изолятов, привезатем .клонйруют в челночный вектор денных в табл.2. Для анализа выражения

"Рзецбоеопаз / Е.соИ, который переносят в .белка:используют АА10, производное rec А непилированный, несклеивающийся штамм от Р678-54. Клонирование М13 и распредеPseudomonas, который, затем анализируют ление фага осуществляют в JM 103. Во всех .

° на адгезию и на образование пилуса. Затем 25 экспериментах хозяином является НВ101 осуществляют мутэгенез данного фрагмен- Е.coll. та в основном таким же образом, как описа- Плазмида р РАР5 представляет собой но в примере 2 в отношейии уропатогенных производную pBR322, несущую хромосомЕ.соИстойразницей,чтоосуществляютана- ный фрагмент EcoR 1-Bam Hl, 9,5 тпо от лизы в Pseudomonas.. 30 Е.соИ J 96. Этот клон выражает пилусовый

Кроме того, если. хромосомную ДНК антиген F "С134.3", который серологически клонируют непосредственно в вектор связан с F 12. Плазмида РДС 5 представляет

Pseudomonas или челночный вектор собой производное рАСУС284, несущее

Pseudomonas / Е.соИ и трансформируют в фрагмент Cial-BamHl 8,0 r.п,о. от E.coÍ lA2 несклеивающийся штамм Pseudomonas, то 35 в то время как pPIL 110 — 35 представляет клоны могут быть отобраны путем непос- собой производное рАСУС184, содержащее .редственного склеивания. Могут испольэо- фрагмент EcoRI 16 т.п.о„выделенный иэ ваться другие анализы. например с Е,coll АД110, ответственный за образоваопределением связывания растворимого ние пилусового антигена F7z. рецептора.. 40 Для отбора используют указанные конПолучение белка слияния в Е.coll осу- центрации антител: карбенциллин 100 ществляют способом, аналогичным опи - мкг/мл, тетрациклин 15 мкг/мл, канамицин санному, хотя возможно должны быть . 20 мкг/мл и хлорамфеникол 20 мкгlмл. Бакискусственно изменены сигналы иницииро-. терии выращивают при температуре 37 С в вания транскрипции и трансляции. Кроме 45 питательном бульоне, Lurla или на агаре того, получение белка может осуществлять- Luria. ся в гомологичных системах a Pseudomonas Общие процедуры.. с использованием например, векторов про- Для трансформации используют проце. мотора Тас в широких пределах (Gene 26, дуру с использованием CaClp. Плазмидную

1983; стр. 273-282).: 50 ДНК выделяют путем модификации методиАнализ на последовательность ДНК и ки щелочного лизиса, после чего ее подвераминокйслотный анализ осуществляют в ос- гают двум последовательным равновесным новном, как описано в примерах 4 и 5, и центрифугированиямвэтидийбромиде. Эн исходя из анализа этой последовательно- донуклеаэы используют в условиях, рекости могут быть полученй синтетические пеп- 55 мендуемых изготовителями. ДНК выделяют тиды, как описано выше.. Методы, в 0,5 -1,5 -ном (вес/об) агарозном геле. аналогичные тем, которые описаны в приме- ДНК фага А и ДНК фага DlX174, расщепленрах 1-5, а также те, которые разработаны ныесоответственно Hindlll и Нае)И, испольдля Рзеиботопаз,могутбытьиспольэованы зуют как стандарты молекулярных весов. для идентификации и получения адгезив- Фрагменты ДНК получают в чистой форме

26

25 путем электроэлюирования из 5,-ных (вес,/об) полиакриламидных гелей.

Процедуры мечения и гибридизации.

Меченые (з P) пробы ДН К приготавливают путем ник-трансляции или путем син- 5 теза основной ДНК, клонированной в однонитевой М13. ДНК плазмиды, фракционированную в агарозном геле, трансформируют на нитроцеллюлоэные фильтры.

Точечные меченые фильтры предвари- 10

0 тельно гибридизуют в течение 2 ч при 68 С в растворе, содержащем: 4xSSC (IxSSC =

150 MM NaCI; 15 мМ цитрата натрия, рН 7), 10 х раствора Denhardt, 0,1 SDS, 2 мМ

ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кисло- 15 та), и ДНК, полученную из клеток зобной железы теленка, озвученную ультразвуком, в концентрации 50 мкг/мл. Затем радиоактивно меченую пробу в свежем растворе гибридизации (1 х 10 отсч/мл) вводят на 20

6 фильтры, которые инкубируют в течение 18 часов в пластмассовых мешках, при температуре 68 С, промывку осуществляют при той >ке температуре или концентрациях солей от 2 х SSC и 0,1 SDS до 0,1 х SSC и 25

0,1/o SDS.

Анализ экспрессии белка.

Плазмиды рРАР5, рРАР502, рДС5 и р

PlL10 — 35 трансформируют в клетку с образованием штамма АА10. Радиоактивные об- 30 . разцы разделяют в 15% (вес./об)

SDS-полиакриламидном геле. Эти гели последовательно закрепляют, окрашивают, обесцвечивают и экспонируют в течение 16 .дней с использованием рентгеновской 35 пленки, .

Определение нуклеотидной последовательности.

Фрагменты ДНК клонируют в M13mp 8 и M13mp 9 векторах фага М13 и трансфор- 40 мируют в штамм Е,соИ М103.

Анализ связывания рецептора.

Связывающие свойства генных продуктов, кодированных плазмидами, приведены в табл.1 и 2, что определяют путем агглюти- 45 нации на предметном стекле с использованием Р1 эритроцитов, содержащих глобозидный рецепторный, и р-эритроциты, в которых отсутствует глобозид.

Анализ пилусового антигена.

Агглютинацию на предметном стекле с использованием антисыворотки, действующей против очищенных Рар пили осуществляют, как описано в разделе "Общие 55 материалы и методы". Антисыворотку используют в 500-кратном разбавлении в PBS рН 7,5/.

Построение производных плазмиды для дополнительных анализов.

Плазмида рРАР43 является производной рРАР5, полученной путем гидролиза

Smal ñ последующим связыванием при низкой концентрации ДНК. В этой плазмиде отсутствует зона Smai>-Smal4 от рРАР5 и, следовательно, она несет лишь гены рарВ и . рарА, Для того, чтобы построить производную рРАР502, плазмиду рДС5 полностью гидролизуют рестриктазой ВоИ1 и частично

Bam HI с последующей трансформацией в

НВ101. Плазмидную ДНК выделяют из трансформантов и отбирают по размеру.

Один клон рРАР502 с правильным размером анализируют дополнительно на отсутствие гена рарС. Плазмиду рРАР503 строят путем связывания фрагмента EcoRI — Hindi ll из pSKS106, несущей протор Iac и правый фрагмент Hindill-BamHI от рДС5, с pBR322, гидролизованной EcoRI u BamHI. Плазмиду рРАР5О4 получают путем гидролиэа рРАР503, рестриктазами Bglll u Bam Hi c последующим связыванием при низкой концентрации ДНК, Плазмиду рРАР507 строят путем клонирования фрагмента Hlndlll из рДС5, несущей гены эквивалентные рарА, рарН и рарС, в уникальную точку Hlndlll от рРАР503, отобранную на устойчивость к ампициллину и для гемагглютинации. Это промежуточное звено (рРАР506) затем гидролизуют Bglll u BamHI с последующим связыванием с образованием рРАР507, аналогичной построению рРАР504 от рРАР503.

Электронная микроскопия.

Электронную микроскопию осуществляют с использованием электронного микроскопа jEOL 100В с медной сеткой размерами отверстий 100 меш, (0,15 мм), покрытой тонкой пленкой из 2/ формвара.

Бактерии суспендируют в 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ NgClz и помещают на сетку, Избыток бактерий немедленно удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Затем сетку промывают буферным раствором и негативно покрывают в течение пяти секунд

3,55% молибдатом аммония с последующей промывкой двукратно дистиллированной водой.

Результаты, Структурное сравнение рРАР5 с рДС5 и

pP1L 10 — 35.

Хромосомные вставки плазмид наносят на карту с несколькими ограничительными эндонуклеазами. Центральный фрагмент

Sma> — Kpnl имеет одинаковый размер (4,6 т.п.о.) во всех. трех плазмидах, В рРАР5 этот фрагмент кодирует часть дополнительного гена, а также гены рарС и рарД. Никаких различий в физической карте этого центрального фрагмента не обнаружено. Следовательно, фрагмент Рзт! размером

27

i 787165

28 примерно 370 п.о. и образованный от зоны кодирования рарС в рРАР5, гибридизуют с фрагментом Pstl равного размера в рДС5 и рРИ 100-35. Аналогичным образом фрагмент Hpal 128 п.о. от N — концевой зоны рарС гибридизуют с фрагментами Hpal аналогичного размера от рД C5 pPII 110-35.

Плазмида pPIL 110 — 35 несет фрагмент

ДНК5,7 т.п.о„который простирается влево от зоны Smal> — Крп!. Эта зона заключает в себе структурный ген для F72-пилин, котарый сохраняет положение, эквивалентное рарА. В этой зоне гомология ограничительной точки не сохраняется, Кроме того, проба длиной 221 п.о. центральной зоны рарА дает лишь слабый сигнал гибридизации с рРИ

110-35 даже при слабом контроле, хотя та же самая зона 5 рар А хорошо гибридизируется в строго контролируемых условиях.

Это говорит о том, что 5 конец двух пилиновых генов хорошо сохраняется, в то время как центральная зона значительно отходит от нормы, Проба ДНК, образованная обычным образом от кодирующей части рарВ, дает сильный сигнал гибридизации с фрагментом Hindlll б т.п.о. от pPIL 110 — 35, подтверждая, что этот ген сохраняется и присутствует в эквивалентных положениях в двух клонах. Три гена, рарЕ и papG, присоединяют к . фрагменту Small-B am Hl плазмиды рРАР5. Ограничительная структура этого фрагмента меньше сохраняется в рДС5 и pPIL 110-35, чем центральный фрагмент Smal<-Kpnl. cDрагмент Smab Bglil от рРАР6 несет papE, papF и 5 -половину рар6. Используя этот фрагмент как пробу в экспериментах по точечному мечению, обнаруживают сигналы равной силы во всех трех анализируемых плазмидах, Проба

BgliI SmalL, несущая 3 -половину рарС, давая сильный сигнал с рРАР5 ДНК, а гибридизируется с рДС5 или pPIL 110-35, даже при слабо контролируемых условиях, Следует отметить, что эти две плазмидь кодируют белки, которые имеют размер, аналогичный размеру рарС от этой зоны. Они имеют аналогичную ограничительную структуру, отличную от рРАР5 в зоне рарС. Для того, чтобы более точно определить границу между гомологией и негомологией, используют большое число клонов М13, несущих зоны

papE, papF u papG.

В. качестве проб используют транслированные никрДС5 и pPIL 110 — 35, Положительные сигналы обнаруживаются во всех

М13 пробах, содержащих рарЕ и рарЕДНК, Ни один из клонов М13, несущих лишь рарОДНК, не дает положительный сигнал, Экспрессия белка в клетках, Ь

40 плазмидах рРАР502.

45 Дополнение между генными скоплени55

Белки, кодируемые плазмидами рРАР5, рДС5 и pPIL 110 — 35, метят(S) метионином в клетках Е.coll и радиоактивно меченые генные продукты анализируют в 15 SDS полиакриламидных гелях. Белки близкого молекулярного веса, такие как рарВ и рарА плазмиды рРАР5, экспрессируются плазмидой pPIL 110 — 35, но не от рДС5. Плазмида рДДС5, как и pPIL 110-35, экспрессирует белок. 71 — 75К и находится примерно в том же положении, что и рарС от рРАР5. Генные продукты рарС от рДС5 и pPIL 110-35 являются слабо выраженными белками с несколько более низким молекулярным весом, чем белок рар С плазмиды рРАР5, в то время как РДС5 и pPIL 110-35 экспрессируют белок с тем же молекулярным весом, что и белок рарД. Для pPIL 110-35 ген, кодирующий данный белок, приближается к зоне, соответствующей рарД, Белок рарЕ плазмиды рРАР5 имеет кажущийся молекулярный вес 16,5 КД. Невозможно обнаружить белок того же размера в рДС5 и pPIL110 — 35, однако несколько меньший белок, выраженный от обеих плазмид, может быть генным продуктом рарЕ от этих генных скоплений. Все три плазмиды экспрессируют белок 15К, который, как известно, кодирует papF, существенный для связывания глобозида. Белок papG плазмиды рРАР5 представляет собой полипептид

35К. Дальний фрагмент Bglll-ВагпН1, являющийся производным от рДС5, рРАР502, не экспрессирует полипептид 36К. Он локализует ген для данного белка в той же зоне, что и рарС в рРАР5, Высоко выраженный полипептид 17К от

РДС5 и pPIL 110 — 35 был приписан периферическому фрагменту Smal — BamHI .этих плазм ид.

В структурах рРАР5 отсутствует ДНК, эквивалентная данной зоне, и следовательно белок 17К не экспрессируется в этих ями в рРАР5 и рДС5, Поскольку рДС5 содержит ДНК в высокой степени гомологичную рарС, рарД, рарЕ, рарЕ, то возникает вопрос, может ли рДС5 быть дополненным рарА в рРАР5, чтобы дать информацию о пилусе рарА. Плазмида несет лишь гены рарВ и рарА, Ни

НВ101, несущий эту плазмиду, ни тот же штамм с рДС5 не агглютинируются анти-пилусовой сывороткой. Однако когда обе эти совместимые плазмиды присутствуют в одной и той же клетке, то рарА-пилин поверхностно локализуется, как это продемонстрировано путем агглютинации антисыворотки, Исследование с помощью

5

35

45

50 электронного микроскопа подтверждает, что рарА-пилин собирается в форме пили, Ни рРАР43, ни рДС5 индивидуально не выражает поверхностно локализованные пили, когда они заключены в НВ101.

Чтобы выявить может ли адгезивная функция также быть дополнена между генными скоплениями, строят рРАР502 с удалением ДНК от точки Bglll к точке BamHI c правого конца рДС5, По сравнению с рДС5 эта производная не выражает 36К и 17К полипептид в клетках, Предполагается, что согласно структурной карте и данным гибридизации, белок 36К соответствует белку

35К, кодированному рарС от генного скопления рар. Плазмида рРАР502, в противопо ложность рДС5, не участвует в гемагглютинации, Используя рРАР16 плазмиду, выражающую papE, papF u papG в рРАР5 в транс, возможно дополнение делеции производной от рРАР502 до гемагглютинации. Таким образом, адгезивная функция может быть также транс-дополнена от одного генного скопления к другому.

Плазмиды рРАР18, рРАР17 и рРАР4, которые представляют. собой мутанты papE I, papFI и papGI, а также плазмида рРАР16 не дополняют делецию на рРАР502. Плазмида рРАР-503, содержащая фрагмент Hindlll—

BamHI от рДС5 под контролем lac промотора, также не участвует в гемагглютинации.

Однако рРАР503 может дополнять дефект в рРАР502, как показано на реакции позитивной гемагглютинации с клетками, содержащими обе эти плазмиды. Эти плазмиды используются для дополнения мутаций в клоне рар. рРАР503 дополняет все мутанты вставки Тп5 в papF и papG, в то время как дальняя производная рРАР504 лишь дополняет их в papF. рДС5-производная р РАР507, кодирующая ген н ые эквиваленты

papG, papE и papF, дополняет pSN 021, несущую Тп5 мутацию в гене papF. Эти результаты показывают, что данные белки, функционально аналогичные генным продуктам papF и papG, кодированысоответствующими зонами на рДС5. Из экспериментов дан:oro примера можно сделать вывод, что ген рарА и в некоторой степени ген рарС, проявляют непосгоянство по трем штаммам Е.coli, в то время как ген papF проявляет очень небольшое непо: стоянство.

Специфичность глобозидного связывания определяют по положительной гемагглютинации на предметном. стекле (НА)

Pl-эритроцитов, содержащих глобозидный рецептор, и по отрицательной гемагглютинации (НА)-р-эритроцитов, где отсутствует глобоэид (табл.З), Дополнение плазмидных мутаций, заключающихся в НВ101, осуществляют путем гемагглютинации на предметном стекле

Р1-эритроцитов. Мутации papEI u papFI являются неполярными мутациями, создаваемыми путем мутагенеза вставок связывающего звена.

Мутация papG I является делецией фрагмента Smal4 — BamHI, приводящей к срезу белка papG посредством IK. Тп5 мутации

papF:;Òï5-021 и papG::Тп5-0,42 внесены в

papF u papG гены, соответственно, Плазмиды рРАР16, рРАР18, рРАР17 и рРАРА представляют собой производные рРАР5.

Плазмиды в левой колонке имеют репликон

PBR322 (рМВ1), в то время как плазмида в верхней колонке имеет репликон рАСУСИ84 (р15А). Гены, указанные в скобках1 1представляют собой рДС5, эквивалентные соответствующим рар генерам в рРАР5.

Пример 8. Гибридизация клинических изолятов Е,coll.

Материалы и методы, используемые в данном примере.

Бактериальные штаммы и плазмиды, f

Образцы, состоящие из 6 изолятов

Е.coli, взяты из мочи пациентов со значительным количеством мочевых бактерий (> 10 бактерий/мл) и 96 фекалиевых изолятов Е.соИ, взятых от здоровых людей. Плазмида рРАР5 несет фрагмент EcoRI BamHI, который содержит все рар-генные скопления. Плазмида рДС5 кодирует глобозидоспецифический адгезин уропатогенного штамма Е.coli 1А (О:6). Недавно было показано, что эти две плазмиды проявляют значительную гомологию по всей основной части рар-генного скопления. Однако ДНК плазмиды рРАР5, производной гена papG, не гибридизируется с рДС5, Последовательность ДНК подтверждает значительные расхождения между генами papG в этих двух клонах.

Среда и условия роста, Полная среда представляет собой питательный бульон Luria om Bertani, дополненный средой Е и 0,2ь глюкозы. Бактерии выращивают при 37 С со встряхиванием.

Для анализа агглютинации используют чашки (или пластины) с агаровой средой агар

Luria, Анализ связывания рецептора.

Для идентификации диглактозидного связывания Е,coli бактериальные клетки, выращенные в течение 22 ч на не содержащем глюкозу питательном агаре Lurla, повторно суспендируют в растворе латексных шариков, покрытых дигалактозидным рецептором. Клетки экспрессируют адгезин, 31

1787165

32 если они агглютинируют шарики в течение одной минуты.

Приготовление хромосомной ДНК.

Каждый бактериальный изолят выращивают в 100 мл среды LB с содержанием 5

4х10 кл./мл. Бактерии собирают путем цена трифугирования, суспендируют в 40 мл PBS (100 мМ К-фосфатного буфера, рН 7,2, 150 мМ ЙаС1), повторно центрифугируют и суспендируют в 5 мл PBS + 0,1 мг/мл 10 протеиназы К, 5 MM ЕДТА и 0,5$ SDS (додецилсульфат натрия). Суспензию инкубируют в течение ночи при комнатной темпЕратуре и, наконец, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом, операцию по- 15 . вторяют дважды.

Il олуче н ие P-радиоактивномеченых

Зг фрагментов ДН К.

Плазмиду рРАР5 и рДС5 гидролизуют с соответствующими ограничительными фер- 20 ментами, и фрагменты ДНК очищают и подвергают Р-мечению посредством никз трансляции.

Процедуры точечного мечения и гибридизации. 25

Два микрограмма хромосомной ДНК растворяют в 1?О мкл 0,1 моль Трис (рН 7,4).

После ввода 30мкл2М1чаОН и 100мкл

3 моль йаС!, 0,3 моль цитрата натрия смесь инкубируют при 80 С в течение 20 мин. Де- 30 натурированную ДНК охлаждают, нейтрализуют 40 мкл 2 моль Трис (рН 7) и наносят на поверхность нитроцеллюлозного фильтра площадью 7 мм, высушивают воздухом г и затем подвергают сушке в вакууме при 35

650С в течение 12 ч, Фильтры инкубируют в течение 2 ч в 10 х Денхардт (Денхардт:

0,02 g поливинилпирролидон, 0,02 Flcoll, 0,02 ВЯА). Их еще раз инкубируют в растворе, содержащем 4xSSC 0,1 SDS, 2 40 ммоль ЕДТА,10х Денхардти 50 мкг) мц ДНК клеток эобной железы теленка (нагретой в течение 3 мин при 95 С) и инкубируют в течение часа при 650С. И наконец их инку-. бируют с радиоактивномеченой пробой в 45 том же растворе, что описан выше, в течение 16 ч при 60 С, затем промывают в 4х

SSC 2 раза по 5 мин и 2х SSC 2 раза по 20 мин при 60 С, а затем высушивают воздухом. Фильтры экспонируют с использовани- 50

- ем Роропт Сгопех 4Х-рентгеновской пленки с усиливающим экраном при -70 С, затем проявляют.

Результаты гибридизации на изолятах

Е.соИ, используемых в данном исследовании. 55

Изоляты

Р-спец,MRHA Моча Фекалии

РспецMRHA 17 4

P-спец.MRHA 7 3

Z-спец. MRHA

Общая MRHA

Без MRHA

Штаммы мочи (66 штаммов) 10

34

3

86

Штаммы фекалия (96 штаммов)

Р-спец MRHA включает штаммы, которые агглютинируют также эритроциты животных, Р-спец MRHA — эритроциты, которые агглютинируют р-кровь человека, 2-спец. MRHA — Никакой гемагглютинации к эритроцитам человека, но к любому из эритроцитов следующих животных: свиньи, овцы, коровы.

Полученные в данном примере результаты показывают, что большое число клинических изолятов штаммов Е.coil, которые связываются с дигалактозидом, содержат области Е, F и 6 в их рар оперонах, и что штаммы, которые не связываются с дигалактозидом, не содержат зон Е, F, 6-рар оперона, хотя они имеют другие зоны в опероне.

Формула изобретения

Способ получения антигенного препарата, обладающего адгезивными свойствами, из фимбрий, предусматривающий выделение хромосомной ДНК иэ урапатогенного штамма Escherichia соН, обработку выделенной ДНК рестриктаэой Sau 3A, кло,нирование полученных фрагментов в плазмидный вектор рНС 7, предварительно гидролизованный рестриктазой. упаковку полученной ДНК в частицы Л-фага, инфицирование упакованными частицами штамма

E.coll К12 или его производных выращивание бактерий на пластинах, содержащих ампициллин, и анализ клонов на функцию адгезии, субклонирование ЕсоИ вЂ” фрагментов клонов, сохранивших функцию адгезии, в pBR322 или рАСУС184, получение мутантов со вставной транспозона с помощью

il-фага CI857 в 221 чех: Тп5, повторное субклонирование фрагмента EcoRI-BamHI, кодирующего образование фимбрий и агглютинина в вектор pBR 322 или рАСУС

184, и получение плазмиды рРАР5, или рАР22, или рДС5, или pPIL 110-35, конструирование производных плазмид рРАР14, или рАР115, или. рРВР9, рРАР16, или рРАР I7, или рРАР138, или рРАР4, или рРАР32, или рРАР58, или рРАР54, или рРАР502, или рРАР504, или рРАР503, или рРАР507, сохранивших ген рарЕ со следующей нуклеотидной последовательностью;

АТОАААААОАТААОАО ОПТО ТО ТСТТ

СCG GТАЛTG СTGGGGG СAGTGTTAATGTCTCAG CATGTACATG CAG TTGATA

A T C T G A С С Т Т С А О А О О А А А33

17871 б5

АСТОАТТАТТССТОССТОТАСТОТААОСАА

C A C A A C T G T T G A C T G 6 C A GGATGTAGAGATTCAGACCCTGAGTCAAAAT

О GAAAT CACGAAAAAGAGTTTACTGTGAATATGCGGTGTCCCTATAATC

T G G G A A C A A T G A A G G T T A CGATAACGGCAACAAACACTTATAACAATGC

Т А Т Т Т Т А G Т Т С А G А А Т А С АТСАААСАСАТСТТСТОАТОООТТАСТСОТТ

ТАТ СТТТАТАА СА6 TAATGCAGGAAATATTG6GACTGCGATAAC

G G А С Т С С А Т Т Т А С G С С С G GAAAAATCACA6GTAATAATG CAGATAAAAC

ТАТАТ СА СТТ САТО С CAAACTTGGATATQAAGGGAATATG CAGAATTTG АТАО С С6 GT CCTTT CTCT6 CAACAG CAACG CTGGTTG САТСАТАТТСО

ТАА или ген рарЕ со следующей нуклеотидной последовательностью

ATGATTCGTTTATCATTATTTATATCGT

TG CTTCTGACATCGGTCG СТ6ТАСТ66СТОАТОТО САОАТТААСАТСАОО

GG GAATGÒÒÒÀÒÀÒÑÑÑÑCCATGCACCATTAATAACGGGCAGAATATT

GÒÒGÒÒGÀÒÒÒÒGG GÀÀÒATTAATCCTGAGCACGTGGACAACTCA

G G Т G А А G Т С А С А А А А А С C ATAAG CATATCCTGTCCGTATAAGAGTGG C

Т СТ СТ СТG G АТААА АG ТТАС666АААТАСТАТ666А66А6ОТСАОАА

ТААТОТА СТ66 CAACAAATATAACTCATTTTGGTATAGCG CTGTATCA6

GG ААААGGААТGТСААСАССТСТТАТАТТА66ТААТ66ТТСАООАААТ6

G Т Т А С G G А 6 Т G А С А G С А G6ТСТ66АСАСАО САС6ТТСААС6ТТСАССТ

TTACTTCAGTG CCCTTTCGTAATGG CAGCGGGATACTGAATGGCGGG

G А Т Т Т С С А G А С С А С О G С С А GTATGAGCATGATTTATAACTGA или ген papG со следующей нуклеотидной последовательностью

ATGAAAAAATGGTTCCCTGCTTTTTTAT

TTTTATCCCTGTCAGGCGGTAATGATGCTTTAG CTGGATGG CACAATGTC

AT6TTTTATG СТТТТАА СОАСТАТТТААСТАСАААТО СТООТААТОТТА

АG GТТАТТGАССААССТCAG CTATATATACCCTGGAATACAGG CTCT

6 CTACAG СААСТТАТТАТ5 TCGTGCTCAGGTCCGGAATTTGCGAGTGG

AGTGTATTTT CAGGAGTATCTGG CCTGGATGGTTGTTCCTAAACATGTC

ТАТА СТААТG АG G G G TTTAATATATTTCTTGATGTTCAGAG CAAATATG

10 6TTGОТCTATGGAGААТGAAAATGACAAAGATfTTTACTTCTTTGTTA

АТG GТТАТG ААТG G G ATACATGGACAAATAATGGT6CCCGTATATGT

Т Т С Т А Т С С Т 6 G А А А Т А Т 615 AAGCAGTTGAACAATAAATTTAATGATTTAG

TATT CAGG GTTCTTTTGССАОТАОАТСТССССАА666АСАТТАТААТ

TTTÑ CTGTGAGATATATACGT6GAATACAG CACCATTACTATGATCTC

20 TGGCAGGAÒÑÀÒÒÀÒÀÀÀATGCCTTACGATCAGATTAAG CAGCTACCT

ОС САСТААТАСАТТОАТ6ТТАТСАТТСОАТААТОТТ66666АТО ССАО

С С G Т С А А С А С А А G Т А С Т Т25 AATATAGACCATGGGAGTATTGTGATTGAT

CGTG CTAACGGAAATAT-.

TAGCAAGTCAGAC6CTTTCAATTTATTGÑ

Т G Т А С С А G Т Т А G Т G Т А А AATATCTCTG CTCAGAAATACACCACCAATA 30 TACAATAATAATAAATTTTCGGTTGGGTTAGGTAATGG CTGGGATTCG

А Т А А Т А Т С Т С Т Т G А Т G G G6ТТОААСАОАОТОАООАААТАТТАСОСТ66

TACACAG С CGG СТСАААА35 ACAGTAAAGATTGAGAGCAGGTTGTATGGT .

G А А G А 6 6 6 А А А G А G А А А ACCCGGGGAG CTATCTGGTTCTATGACTATG

ОТТСТОАОТТТССССТОА лигирование Bg t t t-Sat t t фрагмента — произ40 водных плазмиды с вектором рМС 874, последовательно обработанным эйдонуклеазами Bgllt и ЗаИ!, трансформацию рекомбинантными плазмидными ДНК штамма бактерий Escherichta coll, выра45 щивание, выделение и очистку целевого продукта с помощью аффинной хроматографии.

178Т165

Таблица 1

Характеристики плазмид, используемых для составления карты и функционального анализа рарА, рэрЕ, рарР и papG

Плазм ида

Релевантный генотип

Фенотип пил с-антиген

Гемаггл ютинация

papF:: Тп 5-002

papF;: Тп 5-0 21 рар6:: Тп 5-026

papG:: Тп 5-042

Неупорядоченного типа

pSN002

pSN021

10 pSN026

psN042 рРАР5 рРАР15 рРАР 14

15 рРАР7 рРАР20 рРАР19

Таблица 2

Характеристики штаммов Е.coll u TI и плазмидных клонов, кодирующих соответствующий адгезин

Таблица 3

Поверхностное выражение глобозидо-специфического адгеэина путем дополнения между генами от рРАР5 и рДС5 рРАР22 рРАР23

20 рРАР26 рРАР9

pPAPI рРАР16 рРАР18

25 рРАР17 рРАР4

papFI

papFl

papGI рар EI, Л рар F-G рар FI, Л рар 6

Неупорядоченного типа

papAI

papAI, рар El

Л рар В-D

Л рар В-D, pap GI

Л рар В-D, Lac Рич5

Л рар В-D, Lac Рцч5; рар Ei

Л рар В-D, Lac Puvs, рар Fl

Л а В-О, Lac Puvs a GI