Способ иммуноферментного определения антител класса g к вирусам кори и эпидемического паротита

 

Использование: иммунобиотехнология, диагностика вирусных инфекций и оценка иммуногенности вирусных вакцин. Сущность: вирусы кори и эпидемического паротита ультрацентрифугируют при 25-30 тыс. об/мин в течение 3-4 ч и адсорбируют в лунках полистироловой панели в течение 16-18 ч при4°С. Затем панель трехкратно отмывают, вносят исследуемую пробу и конъюгат меченный пероксидазой хрена и белок A Staphylococcus aureus. Концентрация конъюгата составляет 100 нг действующего начала на 1 мл вносимого в лунки раствора.2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

О (О ((О!! с,з (21) 4883887/13 (22) 23.11.90 (46) 23.01.93. Бюл. N 3 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера (72) В.В.Зотин, M.А,Михайлова и А.Ю,Штык (73) Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера (56) Ведунова С.Л., Мальцева Н,Н, и Решетникова В.И, Сравнительное изучение иммуноферментных тест-систем для быстрого выявления антител к вирусу кори. — Вопросы вирусологии, 1986, ¹ 6, с,752 — 755.

Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и может быть использовано в методах иммуноферментного анализа, в экспериментальной иммунохимии и биотехнологии, сероэпидемиологии, при диагностике вирусных инфекций и оценке иммуногенности вирусных вакцин, Известен способ определения антител к различным вирусам при адсорбции антигенов непосредственно в лунках полистироловых панелей, Однако при использовании этого метода авторы модифицировали планшеты как инфицированными вирусом кори клетками (вирусный антиген), так и неинфицированными клетками культуры ткани (контрольный антиген), не производя при этом никакой очистки вируса от примесных белков. При этом результаты иммуноферментной реакции (ИФР) оценивали по разнице

„„. Ж„„1790769 А3 (я)5 G 01 N 33/535, С 12 N 7/00 (54) СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ КЛАССА О КВИРУСАМ КОРИ И ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА (57) Использование: иммунобиотехнология, диагностика вирусных инфекций и оценка иммуногенности вирусных вакцин. Сущность, вирусы кори и эпидемического паротита ультрацентрифугируют при 25 — 30 тыс. об/мин в течение 3 — 4 ч и адсорбируют в лунках полистироловой панели втечение 16 — 18 ч при 4 С.

Затем панель трехкратно отмывают, вносят исследуемую пробу и коньюгат меченный пероксидазой хрена и белок А Staphylococcus

aureus, Концентрация конъюгата составляет

100 нг действующего начала на 1 мл вносимого в лунки раствора. 2 ил. показателей оптической плотности вирусного и контрольного антигенов, Это неудобно, громоздко и главным образом мало эффективно при выявлении корневых антител в низкотиражных иммунных сыворотках; стандартизовать такую модификацию практически нереально. Кроме того, авторы использовали антитела против глобулинов человека, меченные пероксидазой хрена, причем конъюгацию производили сами в лабораторных условиях, что не обеспечивало стабильности получаемых результатов; нами же использован коммерческий препарат — белок А, меченный пероксидазой хрена.

Вследствие этого конъюгат использовали в одной концентрации согласно утвержденной нормативно-технической документации, В заявляемом способе величина оптической плотности используемого коньюгата составляет 2,63 ед.

1790769

10

20

Известен также способ определения противовирусных антител класса G в иммуноферментном анализе (ИФА), включающий очистку вируса ультрацентрифугированием с последующей модификацией им полистиролового носителя в форме шариков и постановкой ИФР на планшете в присутствии конъюгата на основе антител к иммуноглобулинам класса G.

Однако, данный способ является сложным и мало чувствительным в случае определения антител к вакцинйым штаммам вирусов. В описании прототипа нет сведений о величинах концентраций модифицирующего агента; нами же отработаны оптимальные условия данной операции:

2,5 — 5 мкг/мл для штамма "Эдмонстон" вируса кори; 20 мкг/мл для штамма "Ленинград-16" вируса кори; 15 — 20 мкг/мл для штаммов "Эндерс" и "Ленинград-3" вируса эпидемического паротита. Предлагаемый нами способ более чувствителен (выявляет антитела в концентрациях в 5-10 раз меньших), чем аналогичные способы, при которых детекцию антител проводят с помощью энзим-меченных антител в качестве антиглобулиновых конъюгатов.

Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа при полном сохранении специфичности.

Указанная цель достигается тем, что в способе, предусматривающем очистку вирусов центрифугированием с последующей адсорбцией их на поверхность полистиролового носителя и постановку ИФР с исследуемыми пробами в присутствии конъюгата и последующим учетом результатов, имеются следующие отличия: очистку вирусов проводят ультрацентрифугированием при факторе разделения 25 — 30 тыс, об/мин в течение 3 — 4 ч; поверхность лунок полистиролового планшета модифицируют очищенными вирусами в концентрации 5 — 20 мкг/мл и при определении противовирусных антител в качестве коньюгата используют белок А золотистого стафилококка, меченный пероксидазой хрена.

На фиг. 1 и 2 иллюстрируют предлагаемый способ.

Пример 1, Определение антител класса

G к вирусу кори (в качестве иммуносорбента использован штамм "Ленинград-16"), Стадия 1. Определение концентрации иммуносорбента.

Готовят последовательные разведения очищенного ультрацентрифугированием вируса кори, штамм "Л-16" от 2,5 до 25 мкг/мл на карбонатно-бикарбонатном буферном растворе 0,05 моль/литр с рН = 9,5 0,1 (КБК). В качестве контрольных сывороток при постановке ИФР используют сыворотки крови человека: иммунную (с титром 1 5 в РТГА с 4 ГАЕ коревого диагностикума) и неиммунную (корневые антитела не выявлены при постановке РТГА с 1 ГАЕ коревого диагностикума) в разведении 1:100 на 0,01

М фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением хлористого натрия, 0,15 моль/литр и 0,05% твина-20 (ФСБ-Т). рН раствора 7,2 — 7,4. Постановку ИФР осуществляют на полистироловых плоскодонных планшета для иммунологических реакций (производства Ленинградского завода "Пластополимер"), Для этого: приготовленные разведения вируса в объеме 0,1 мл выдерживают в лунках планшета в течение 16 — 18 ч, при 4 С, либо 2 ч при 2 С, после чего его удаляют и проводят трехкратную промывку лунок раствором ФСБ-Т, Затем в лунки планшета вносят иммунную и неиммунную сыворотки в вышеуказанном разведении, выдерживают 1 ч при 37 С, далее содержимое лунок удаляют и вновь проводят трехкратную промывку лунок раствором ФСБ-T.

После этого в лунки вносят конъюгат — белок

А, меченный пероксидазой хрена, приготовленный на растворе ФСБ-Т (концентрация конъюгата — 100 нг действующего начала на

1 мл раствора; объем, вносимый в лунку — 0,1 мл), Раствор конъюгата выдерживают в лунках в течение 1 ч при 37 С, затем его удаляют и проводят пятикратную промывку лунок раствором ФСБ-Т. Затем в лунки планшета вносят по 0,1 мл хромоген-субстратной смеси, приготовленной непосредственно перед использованием следующим образом: в 10 мл 0,2 моль/л фосфатно-цитратного буферного раствора с рН 5,0 (ФЦБ) растворяют 4 мг ортофенилендиамина дигидрохлорида и

0,010 мл 307-ного раствора перекиси водорода. Смесь выдерживают в лунках 30 мин в темноте 18 — 22 С, затем реакцию останавливают путем добавления 1 н. раствора соляной кислоты по 0,1 мл в каждую лунку.

Результаты анализа фотометрируют на вертикальном спектрофотометре любой конструкции при длине волны проходящего света 492 нм. Полученные результаты ИФР представлены на фиг, 1. При этом видно, что максимальная разница в показателях оптической плотности (ОП) между иммунной и неиммунной сыворотками соответствует уровню концентрации штамма "Л-16" вируса кори в 20 мкгlмл. При этом у неиммунной сыворотки показатель ОП должен быть обязательно ниже уровня 0,2, а у иммунной— выше этого значения.

Стадия 2, Скреннинг-анализ исследуемых сывороток в ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "Л-16" вируса кори.

1790769

Для проведения данного исследования взято 206 сывороток крови от взрослых доноров в возрасте 27 — 47 лет, Все сыворотки были исследованы предварительно в РТГА с 4 ГАЕ коревого диагностикума, и те из них, которые не содержали специфических антител, были переставлены в РТГА с 1 ГАЕ коревого диагностикума. Техника постановки ИФР с данными сыворотками аналогична описанной выше, использованной при определении концентрации иммуносорбента. При проведении анализа особое внимание обращали на результаты постановки

ИФР с группами сывороток, где коревые антитела не были обнаружены в РТГА с 1

ГАЕ и с минимальными титрами (1:5), т.к, последняя группа является в эпидемиологическом отношении наиболее уязвимой в плане частичной утраты иммунитета к вирусу кори с течением времени. В то же время титр 1:5 с 1 ГАЕ принято считать защитным, Каждая из исследованных сывороток была проставлена в ИФА в двух параллельных лунках и в анализ брали среднеарифметическое значение. Суммарные результаты данного исследования представлены в табл. 1.

Из представленной в табл. 1 видно, что все исследованные сыворотки, являющиеся неиммунными по данным РТГА, имели при постановке ИФА показатели ОП ниже, чем

0,2 (при максимальном значении 0,17; минимальном — 0,12 и среднем — 0,13). В то же время, все иммунные по данным РТГА исследованные сыворотки, в том числе и с минимальными титрами, имели аналогичные показатели достоверно выше 0,2, Все вышеизложенное свидетельствует о высокой чувствительности данного способа при определении коревых антител в том числе и к вакцинному штамму, т.к, среди исследованных сывороток примерно 50/ составляют сыворотки от привитых и о пригодности теста для проведения скреннинганализа с целью выявления специфических антител класса G к вирусу кори (поскольку используемый конъюгат позволяет обнаружить практически все имеющиеся антитела класса G и частично М.

Пример 2. Определение антител класса G к вирусу кори (в качестве иммуносорбента использован штамм "Эдмонстон" вируса кори, Стадия 1, Определение концентрации иммуносорбента.

Готовят последовательные разведения очищенного ультрацентрифугированием штамма "Эдмонстон" вируса кори 2,5 — 25 мкг/мл на растворе КБК, Контрольные сыворотки и все остальные ингредиенты, необходимые при постановке ИФР, те же, что и

50 в примере 1. Однако концентрация конъюгата составляет в данном случае 200 нг действующего начала на 1 мл раствора, Методика постановки ИФР аналогична примененной в примере 1. Полученные при этом результаты представлены на фиг, 1. При этом видно, что максимальная разница в показателях ОП между иммунной и неиммунной сыворотками соответствует уровню концентрации штамма

"Эдмонстон" вируса кори в 2,5 — 5 мкг/мл.

Стадия 2. Скреннинг-анализа исследуемых сывороток в ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "Эдмонстон" вируса кори.

Для проведения данного исследования взяты те же 206 сывороток от взрослых доноров, что и в примере 1, Суммарные результаты данного исследования представлены в табл. 2. Из табл, 2 видно, что все неиммунные (по дачным РТГА) сыворотки имели в ИФА показатели экстинкции ниже 0,2; в то же время все иммунные сыворотки, втом числе и низкотитражные, имели показатели ОП выше 0,2.

Анализ сопоставления данных табл. 1 и

2 свидетельствует о высокой чувствительности способа при определении коревых антител класса G к вакционному и "дикому"

LUTBMMBM BMP /cB KOPM.

Пример 3. Определение антител класса F к вирусу эпидемического паротита (в качестве иммуносорбента использованы штаммы "Ленинград-3" и "Эндерс").

Стадия 1. Определение концентрации иммуносорбента.

Исходным сырьем для получения иммуносорбентов служили: а) вируссодержащая аллантоисная жидкость — штамм "Эндерс" и б) культуральная вируссодержащая жидкбсть — штамм "Л-3", Оптимальным режимом очистки для приготовления качественного иммуносорбента явилось ультрацентрифугирование в режиме 25 — 30 тыс. об/мин в течение 3 — 4 ч.

Готовят последовательные разведения обоих иммуносорбентов в концентрации от

5 до 25 мкг/мл на растворе КБК. Контрольными сыворотками служили; а) неиммунная (не имеющая антител к вирусу эмидемического паротита (ВЭП) по данным реакции нейтрализации (PH) и торможения гемагглютинации (РТГА); б) иммунная низкотитражная (титр специфических антител по данным PH составляет 1 4, а по данным

РТГА 1:10). В анализ намеренно взята такая низкотиражная сыворотка, т.к, ее титр соответствует минимальному защитному, гарантирующему невосприимчивость микроорганизма к ВЭП. Все вспомогательные ингредиенты, необходимые для постановки

ИФР аналогичны использованным в приме1790769

Формула изобретения

Таблица 1

Выявление коревых антител класса G методом ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "Л вЂ” 16" вируса кори

Показатели оптической плотности 1=492 нм

Количество исследованных сыТитр вРТГА среднеарифметический минимальный максимальный

0,13 - 0,02

0,47 0,05

0,85 0,04

0,93ч- 0 05

0,97+ 0,05

1,28ч- 0 12

0,12 0,02

031+ 0,05

0 68ч- 007

0,71++ 0,04

0,65 + 0,04

1,12ч- 0,1

0,17+ 0,01

0,69+. 0,04

0,93+ 0,05

1,124 0,1

1,19+ 0,9

1,34» 0,14

<1;5 с 1 ГАЕ

1:5с1 ГАЕ

1;5 с 4 ГАЕ

1:10 с 4 ГАЕ

1:20 с 4 ГАЕ

1:40 с 4 ГАЕ и выше ре 1. Концентрация конъюгата составила

100 нг действующего начала на 1 мл раствора, Методика постановки ИФР аналогична приведенной в примере 1, Полученные при этом результаты представлены на фиг. 2, На представленной фиг. 2 видно, что максимальная разница в показателях ОП между неиммунной и иммунной низкотитражной сыворотками соответствует уровню концентрации обоих примененных иммуносорбентов в 15 — 20 мкг/мл, При этом отчетливо видно, что для постановки ИФА пригодны оба иммуносорбента, в то же время использование для адсорбции на твердую фазу очищенного ВЭП на основе штамма "Л-3" предпочтительнее, т.к. показатели ОП иммунной сыворотки приближаются к 0,5 (при использовании ВЭП штамма "Эндерс" — на уровне 0,3) при экстинкции неиммунной сыворотки на уровне, ниже чем 0,2.

Стадия 2. Скреннинг-анализ исследуемых сывороток в ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штаммов "Л-3" и

"Эндерс" вируса эпидемического паротита, Для проведения данного исследования взяты 109 сывороток от взрослых доноров в возрасте от 27 до 42 лет. Все сыворотки были исследованы предварительно в РТГА с паротитным диагностикумом(с 2 ГАЕ), Техника постановки ИФР в данном случае аналогична использованной при определении концентрации иммуносорбента. При этом особое внимание обращали на результаты постановки ИФР с сыворотками, неиммунными по данным PH и РТГА (21 сыворотку, неиммунную по данным РТГА дополнительно исследовали в рН с 31 ГАдЕ50/0,5 мл

ВЭП, и специфических антител при этом также не обнаружили). Каждая из исследованных сывороток проставлена в ИФА в двух параллельных лунках и в анализ брали среднеарифметический показатель, Суммарные результаты данного исследования отражены в табл, 3, Из табл, 3 видно, что все неиммунные по данным РН и РТГА сыворотки имели в ИФА показатели ОП ниже 0,2; в то же время все иммунные сыворотки имели аналогичные

5 показатели выше 0,2.

Таким образом, выполненные примеры демонстрируют достижение целей изобретения, Использование данного способа позволяет по сравнению с прототипом;

10 1. Упростить анализ за счет исключения из ИФР модифицированных полистироловых шариков. Это изъятие имеет следствием сокращение комплекта тест-системы и ее удешевление.

15 2. Повысить чувствительность способа.

Этот вид положительного эффекта проиллюстрирован приведенными примерами, из которых видно, что чувствительность данного способа находится на уровне наног20 раммовых концентраций антител в 1 мл исследуемых сывороток при полном сохранении специфичности, как при выявлении антител к "диким", так и вакционным штаммам на модели вирусов кори и эпидемиче25 ского паротита.

Способ иммуноферментного опреде30 ления антител класса G к вирусам кори и эпидемического паротита, предусматривающий очистку вирусов центрифугированием, адсорбцию их на полистироловом носителе, добавление исследуемой пробы и

35 антиглобулинового реагента с последующим учетом результатов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, очистку вирусов проводят при 25 — 30 тыс. об/мин в течение 3 — 4 ч, 40 на полистироловом носителе их адсорбируют в концентрации 5 — 20 мкг/мл, а в качестве антиглобулинового реагента используют конъюгированный с пероксидазой хрена белок А Staphylococcys aureus.

10

1790769

Таблица 2

Выявление коревых антител класса G методом ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штамма "ЭДМОНСТОН" вируса кори

Таблица 3

Выявление паротитных антител класса G методом ИФА с использованием в качестве иммуносорбента штаммов "Л вЂ” 3" и "Эндерс" вируса эпидемического паротита

Показатели ОП Ъ492 нм

Количество исследован- ных сывороток

Титр вРТГА с

2 ГАЕ паротитного диагности кума

Штаммы для приготовления иммуносорбента среднеарифметический минимальный максимальный

<1:5

1;10

1:20

1:40 и выше

10

20

"Эндерс"

"Л вЂ” 3"

"Эндерс"

"Л вЂ” 3"

"Эндерс"

"Л вЂ” 3"

"Эндерс"

"Л вЂ” 3"

0,16»- 0,01

0,17»- 0,01

0,43+ 0,04

0,53+ 0,03

0,87+ 0,06

1,05» 0,06

1,02»- 0,05

1,26»+. 0,08

0,03»- 0,01

0,05»- 0,01

0,31 »- 0,03

0,35"- 0,02

0,62» 0,04

0,84+. 0,02

0,88»- 0,04

1,04»- 0,06

0,08»- 0,01

0,1» 0,01

0 38»-0 03

0,41» 0,01

0 78»-0 02

0,93»- 0,02

0,93»- 0,02

1,12» 0,02

1790769

О,б

О, !-!

0,$

О,7

0,1

° ° э

° Ю ° 1

1 он ен" ац!я и.,!!, „";:".ñ oï!! åí Tà

° °

° ° ° Е

"кг/"и

qC;r;

25 50

10,С< с-ь iapoткк С;:5 с Т ГйЕ ти и

1 та! !! т:5 с 4 ГйЕ

".лорот ки оптической п-отности° ° ° г ° ° L.та, д1! 1

H !! tl с . . ° н! a ° ° y! т -га s yl

°,J с!„т,.o ;ä кy, "=,;.! . c тки.1: и з ° с с4ГйЕ с ;ГАК

1790769

492 п-отности

0.6

O,Ц

) ° ° ) ° ° ° °

° ° ° ° °

° ° ° °

O,z

° )

° )

° ° г онцентрзция "..:.уносороента

2Са 250 нкГ/ил

5,0 т;.тр "blp.îñëòêä 4 J. ! ктг, 1 ° с ) l ) ) сна ".-.к !! ь ..< с Г)

Составитель В.Зотин

Техред М.Моргентал КоРРектоР З.Салко

Редактор Т. И ва нова

Заказ 375 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Пока зате "и оптической

° °

) °

) °

° °

:!!)1 Е!.! )!)L 1) 1 °

1, 11

bк ав,л,! «1,;, Згура -31

) 1 ) О!11 Т г.Г

Л 1 ° „ с с 1 ч) с )." ГАс,