Рекомбинантная плазмидная днк альфа ri-7, предназначенная для маркирования 1-ой хромосомы человека

 

Использование: в генетической инженерии и в медицинской генетике для идентификации хромосомы 1 в норме и патологии. Сущность-изобретения заключается втом, что рекомбинантная ДНК содержит геномный фрагмент ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющий четыре внутренних уникальных сайта рестрикции BspR1 с центромерным районом хромосомы-1 человека.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

OlilMCAHNE ИЗОбРЕТЕНИЯ

АТЕНТУ (2 1) (22) (46) (71) инс (72) I (73) ски гии (56) инж ван мож тик сом пре ку ане так ген нир для кач уни ные поз ляр низ мен циф

890060/13

1.12.90

0.01.93. Бюл. М 4 осковский научно-исследовательский итут педиатрии и детской хирургии .Б,10ров, С.Г.Ворсанова и А.Г.Яковлев

Московский научно-исследовательинститут педиатрии и детской хирур3 РСФСР

rends Genetisc, 1987, v.3, 192 — 198.

hromosoma, 1982, v.87, 491 — 502, 4эобретение относится к генетической нерии, в частнос и к области конструироя молекулярно-генетических маркеров. и т быть использовано s медицинской генедля достоверной идентификации хромо-! 1 человека в норме и патологии, включая атальную и постнатальную диагностиромосомной патологии, диагностику плоидий при различных формах рака, а е для цитогенетического картирования ма человека.

Известно, что к настоящему моменту клованы и охарактеризованы ДНК-зонды различных хромосом человека. Однако в стве ДНК-зондов чаще всего испольуют альные (однокопийные или малокопийпоследовательности ДНК), которые не

ollAIoT проводить эффективную молекуо-цито генетическую диат костику из-за ой разрешающей способности совре- .

ых цитогенетических методов, Исключением являются хромосомо-спеичные ДНК-зонды, содержащие повто„, Я „„1792429 А3 (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

АЛЬФА R1-7, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ

МАРКИРОВАНИЯ 1-ОЙ ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА (57) Использование; в генетической инженерии и в медицинской генетике для идентификации хромосомы 1 в норме и патологии, Сущность изобретения заключается в том, что рекомбинантная ДНК содержит геномный фрагмент ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющий четыре внутренних уникальных сайта рестрикции BspR1 с центромерным районам хромосомы-1 человека. ря ющиеся (м но гоко пий ные) посл едовател ьности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлитные ДНК), На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК-зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом II и Х человека (No1203108 и No1494724), Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК-зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классическйх сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека.

Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой, В частности. обнаружен малокопийный вариант альфоидной ДНК. человека, который имеется в хромосоме 1 (Willard et al., 1989). Этот ДНКзонд не позволяет эффективно маркировать хромосому 1 человека, т,к. гибридиэуется

1792429 кроме хромосомы l с рядом другим хромо- . Новый ДНК-зонд отличается сом — ll. 17 и X. тличается от известных геномным фрагментом ДНК человека в нии, имеющего чеОписан также вариант "классической" размером 680 пар оснований сателлитной ДНК человека, специфичный тыре внутренних уникальных сайта рестрикдля района вторичной перетяжки {район 5 ции BspR1 и ограниченного Е Rl.1 i)х

g 1) хромосомы t (Cook et al,. 1982). Этот сраэных концов геномного фрагмента. Крорайон характерен для длинного плеча хро- ме того, этот новый ДНК-зонд отличается мосомы 1. Актуальным для молекулярно-ци- минорными сайтами гибри иза ии тогенетич ескои диагностики остается мосомах человека в условиях in situ, которые конструирование маркера для центромер- 10 включают хромосомы 5,7,19. В специальных ного района хромосомы I человека,,который условиях, описанных в примерах и способе позволил проводить маркирование и иденти- - использования, этот (НК-з б фикацию центромерного района хромосомы ся только с центромерным районом хромосоI в интерфазных и метафазных клетках. мы! человека.

Изобретение не имеет аналогов, так как 15 Конкретная цель исследования достигаподобная рекомбинантная плазмида для лась следующим образом. высокоспецифичного маркирования цент- Источником выде

ыделения маркерного ромерного района хромосомы I человека фрагмента альфа-R l-? служит ДНК лимфоразработана впервые. Полученная реком- цитов человека, очищенная методом электбинантная плазмида альфа-Rl-7 отличается 20 рофильтрации на ф ии на ультра рильтрующей от известных по литературе клонированных . мембране типа XM-300 "А I ", П

m соп, репарат сателлитных ДНК по способу получения, по очищенной лимфоцитарной ДНК человека рестриктной карте и размерам вставки аль- (полученный от индивидов мужского пола) фоидной ДНК человека, по особенностям . обрабатывают рестриктазой EcoR1 до полхромосомной локализации и по высокой спе- 25 ного гидролиза, Полученные рестриктные цифичности для хромосомы i человека. Пред- .. фрагменты "вшивают" с помощью лигировалагаемое техническое решение не имеет ния по "липким" концам в Есой1-сайтбако щих признаков ни с одним из приведенных териального плазмидного вектора рВВЗ25 выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитоге- (4,3 т.п.н.), Данная плазмида несет ген уснетического маркирования и идентификации 30 тойчивости к ампициллину, Наличие гена центромерного района хромосомы (человека устойчивости к ампициллину в плазмиде по- . данное техническое решение разработано зволяет на среде с этим антибиотиком отбивпервые. рать только трансформированные клетки, Таким образом, данный вектор no=-воляет

Целью изобретения является создание 35 создать рекомбинантную клонотеку(по типу нового молекулярно-генетического маркера "short-gun") при автоматической селекции

-й хромосомы человека, специфичного для на среде с ампициллИном. центромерного района, включая гетерохро- На следующем этапе в созданной кломатин обоих плеч, применение которого по- нотеке идентифицируют клоны, обладаюзволяет проводить простым способом 40 щие гомологией с альфа-ДНК. Для этого. диагностику аномалий хромосомы I в меди- рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозцинской генетике и онкогенетике. ных фильтрах вводят в реакцию гибридизаущность изобретения заключается в ции с меченной радиоактивным фосфором том, что клонированный фрагмент ДНК аль- (з2p)ДНК .тотальной фракцииАИ-ДНКчелофа-R1-7излимфоцитовчеловека,представля- 45 века, которая представлена, в основном, ющий собой последовательность альфоидной альфоидной ДНК. Кало, ДН К, пНК

Д человека, используется в качестве спе-:"дает позитивные рефлексы на радиоавтогцифического молекулярного маркера 1-A хро- рафах в результате гибридизации, отбирают мосомы человека, Данный фрагмент имеет и используют для определения хромосомдлину 680 пар нуклеотидов и состоит иэ 4-х 50 ной локализации клонированных в них реальфоидныхмономеров(длиной170н.п,каж- стриктных фрагментов ДНК человека, дый), расположенных тандемно, т,о. пО типу непосредственно в цитологических препа3 конец предыдущего мономера 5 концу по- ратах хромосом ln situ. следующего мономера. Для этого препараты хромосом готовят

Данная последовательность нуклеоти- 55 иэ делящихся клеток в культуре лимфоцитов дов относится к клвссуальфоиднойДНК, что периферической крови по известному методокаэано при проведении рестрикционного ду. Стимулирование к делению с помощью картирования ДНК-зонда, опытов по блот- фитогемагглютинина{фирма "Дифко", США) гибридизации и по гибридизации на хромо- лимфоциты крови культивируют в пеницилсомах in situ, линовых флаконах при 37 С в среде Иг а с

1792429 добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 часов, За 1,5 часа до конца культивирования вводят колхицин в концентрации

0,5 мкг/мл, Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCI и инкубируют 10 минут п и 37 С. Фиксацию проводят метанол-укс /сным фиксатором (в отношении 3:1) трижды по 20 минут. Препараты хромосом хранят при 37 С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления, Образцы ДНК для гибридизации на хром сомах!и situ метят изотопной меткой изв стным методом замещения; в 100 мкл д ионизированной воды растворяют послед вательно 15 мкл десятикратного буферног раствора (0,8 M трис-HCI, рН 7,4; 0,1М

МоС!г; 0,05М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоа тивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в э вимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого

3 исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл

Д К-аэы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 м л Н-тимидинтрифосфата (удельная акт вность 114 Ки/моль, концентрация 5 м и/мл, 10 мкл ДН К-полимеразы-1 (кон цент ация 2 ед/мкл). Обьем реакционной смес составляет 150 мкл, Реакцию проводят

2 — 40 минут при 20 С. Средняя удельная р диоактивность меченых препаратов ДНК с ставляет около 25х10 импульсов в минуб т в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченой радиоактивным предшественниками рекомбинатной

Д К альфа-Rl-7 с метафазными хромосомам in situ проводят по следующей методике: и епараты метафазных хромосом денатур руют в течение 30 секунд в 0,07 N NaOH с оследующей промывкой по 10 минут в 70 и 96 спирте; препараты радиоактивных о разцов.ДНК денатурируют в гидридизац онной смеси, содержащей 50% формамида, 1 % декстрансульфата-500 и стандартный сол вой раствор (2 SSC), в течение 10 минут и и IOO C в течение 17 — 18 часов. Препарат после проведения гибридизации промыв ют в двух сменах 2xSSC при комнатной т мпературе, в 70 и 96%-ом этиловом спирт по 15 минут в каждой смене. После высуивания на воздухе препараты покрывают ф тоэмульсией типа М и экспонируют в темн тедо10дней. Послепроявления стандарт ым эмидоловым проявителем препараты в течение 2 мину тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3 -ным р створом красителя Романовского-Гимза в

0 02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение

1 — 15 минут Радиоавтографы анализируют.

55 После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют иэ цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 M TE.

Для препаративного выделения плаэмидной ДНК со вставкой ДНК человека

50 и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 х или 1125 х.

Гибридизация In situ на метафазных хромосомах человека показывает. что клонированный фрагмент pBR325 локализован в прицентромерном районе 1-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды альфа-RI-7 идентификации хромосомы! человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят

0,015М NaCI объемном соотношении 1:3.

Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом-500 в соотношении 5:1: смесь отстаивают

30 минут при комнатной температуре: see последующие процедуры проводят при 04 С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 минут и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15М NaCI (450g, 10 мин), Отмытые клетки ресуспендируют в буфере CTM. содержащем 0,5 M сахарозу, 50

MM трис HCI (рН 8,0) 5 мМ MgCI, 0,02 mM

EDTA с тритоном X-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифу ированием в том же буфере без тритона X-100 (450g, 10 минут).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50

MM трис HCI, рН 8,0; 5 MM ЕОТА) из расчета:

100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением серкозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при 65 С не менее 1 часа до полного просветления и центрифугируют 60 минут при 2000 об/мин. для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром XM-300 ("Amicon").

На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют отанодной камеры диализной мембраной, Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, с держащим 89 мМ трис

НС1, 89 мМ НВО и 5 мМ Е0ТА (рН 8,3).

Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см в течение 6-8 часов.

1792429

Е,Coti, несущую плазмиду, выращивают в

100 мл среды LB (10 rjn пентона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCI) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при 37 C на качалке в течение 5

12 часов. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин., 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-H CI (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5 раствора тритона Х-100; К суспензии добавляют 10 свежеприготовленный раствор лизоцима до

5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 минут. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65 С, 15

ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин. в течение 10 минут. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл PHK-азы А и после 2 часов инкуба- 20 ции при 65 С проводят фенольную. а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-.18 С. 20 мин.), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диазируют 25 на сефадексе G-50 против 0,1х$$С (1xSSC

18 г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата.. натрия). Этот раствор прогревают при 81 С в течение 10 минут и быстро охлаждают добавлением объема 1М KCI + 20 мМ трис- 30

НС(рН 7,1 при 0 С, Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой

Nitro-Cell-S ($егча) из расчета 1 мг ДНК на . 10 см обьема колонки. Фракции. содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, 35 объединяют, ДНК из них осаждают равным, объемом изопропилового спи рта; осадок . промывают 50 -ным изопропиловым или

70 -ным этиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют я буфере ТЕ до 40 нужной концентрации, ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин. в течение 10 45 минут, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCI (рН 8,0); 20 мМ ЕРТА, 50 MM глюкозы и 2 мгlмл лизоцима с последующей йнкубацией в течение 30 минут при 0 C.Ê пробе добавляют 2 мл раствора 0,2 н. МаОН 50 с 1 SDS и йосле тщательного перемешивания продолжаЮт инкубацию 5 минут. К лизатудобавляют1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при 0 С. Образующийся осадок 55 удаляют центрифугированием(1200 об/мин.), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (.18 С, 30 мин.). Осадок растворяют в 1 мл

50 мМ трис-НО (рН 8,0) + ),1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ, Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 MM трис-HCI (рН ?,4), 10 MM MgCI, 10 мМ йаО и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5 — 8 едlмкг ДНК после проведения реакции в течение 2 часов при 37 С. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70 С в течение

10 минут или добавлением 1/4 обьема смеси

0,1 %-ного раствора SDS 25 /0 ного раствора сахарозы, 5мМ ацетат . натрия и 0,05 -ного раствора бромфенолояого синего.

Для получения геномной клонотеки

ДНК человека в качестве вектора использу-— ют бактериальную плазмиду pBR325 несущую ген устойчивости к ампициллину, и последовательность фага Ми. обуславливающую признак "убийства", в которой расположен уникальный сайт для рестриктазы

Есой1, Данное сочетание позволяет проводить одноэтапный отбор рекомбинантных клонов при клонировании фрагмента ДНК человека в EcoR1-сайте плазмиды.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры Е.coil HB

101 выращивают на качалке при 37 С до мутности А = 0,4 — 0.5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 минут, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 10 минут.на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до 0 С1 . раствора 100 мМ

СаО2, клетки осаждают и ресуспендируют

12 мл 100 мМ СаС(2, Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 минут, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1М CaCI2 с 15 -ным глицерином, После инкубации полученной суспензии при

0 С по крайней мере в течение 30 минут культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80 С, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4 — 5 месяцев, К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0 С добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42 C) на

60-90 С и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 часа при 37 C. Трансформанты высевают на

1792429

10 ллггтную среду с а,б g агара (ло 0.1 мл культурны на чашку Петри) и добавляют необходигкые антибиотики. обуславливающие се екцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора. содержащего 0,1-0,2 мкк че ба тес тн ны не пи щи ши на тав ни его тво ром 1 м трис-НГ! (рН 7,5). а затем 1,5 М йа I с 1 M трис HCI (рН 7,5). Высушенный на оэдухе фильтр помещают в раствор 2 SSC с п отеиновой К в концентрации 50 мкг/мл и ин убируют в нем 30 минут пои 37 С, Далее по сушенный фильтр промывают в 0,3 М

Na I, а затем сушат под вакуумом при 80 С в т чение 1-2 часа, Перед гибридизациеи фильтр вымачит при 68 С в растворе 2xSSC, 0,5% SDS ,ь фикол-400 и 0,1% поливинилпирроли-350 в течение 60 — 90 минут, Вслед за м фильтр насухо промакают фильтроьной бумагой и помещают в 4-5 мл гибизационной смеси. содержащей 6xSSC; SDS; 10% декстрансульфата-500, 50

/мл, поли(А) и денатурированную пробу

-меченной ДНК с суммарной активностью х10 имп./мин. Гибридизацию проводят

68 С в течение 18-24 часов. Фильтры (.1

1— пр ти мк ин ра

10 бу

50 об пр из уд

Ки ра ви теч ки ря

Il P ме им плазмиднои ДНК или 0,1 мкг препара о выделенного из геля фрагмента и 1

ДНК-азы-1 в 0,015 М MaCI,5 мМ CaClz, бируют 10 минут при комнатной темпере, ДНК-азу-1 инактивируют при 70ОC инут, после чего к раствору добавляют рный раствор 0,4 М трис-HCI (рН 7,4);

M Mg CIz, 25 мМ 0ТТ (до 1/5 конечного ма), по 1 нмолю каждого из немеченых шественников ДН К, 20 — 40 мкКи одного

Р- дезоксинуклеозидтрифосфатов с ьной активностью 110 ТВ!ммоль (3000 ммоль) (Amersham) и 1 ед.ДНК-полиме-1, Объем реакционной смеси, как пра, составляет 100 мкл, реакцию ведут в ние 1 часа при 37 С, Радиоактивность отонерастворимой фракции ДНК измет на счетчике LRB 1215 по специальной рамме. Средняя удельная активность ных препаратов составляет 2 — 5х10 в

/мин./мкг ДН К.

Для идентификации вставок ДНК овека в составе гибридных клонов териальный колонии, предварительно ированные по фенотипу как рекомбинане, рейликой наносят на нитроцеллюлозфильтры (Milli pore, HAWP), находящиеся осредственно на поверхности твердой ательйой среды в чашках Петри, и выраают их в течение суток при 37 С. Выросколонии вместе с фильтром переносят оверхность раствора 0,5 М NaOH и осяют на 5-10 минут. Подсушив фильтр с ней стороны фильтровальной бумагой, дважды по 10 минут обрабатывают распромывают в нескольких сменах раствора

0,5xSSC с 0,5% ЯОЯ при 68 С в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету

5 с рентгеновской пленкой PM-1. Через 2 — 24 часа экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

10 Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой EcoR1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для тибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной

15 ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной

ДН К человека эндонуклеазой EcoR1 и идентификации полосы AR1 (340 н.п.), В указан20 ный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колойиях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых

25 получила название альфа-RI-7.

Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемаглютинина (фирма "I3ifco", США) в

30 пенициллиновых флаконах при 37 С в среде

Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 часов. 3а час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культиви35 рования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 M KCI u инкубируют в течение 10 минут при 13ОC.

40 Фиксацию проводIIT метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по

20 минут. Препараты хромосом хранят при

27 С и используют в опытах не позднее 23-х недель после приготовления.

45 Образцы ДНК для гидридизации на хромосомах In з1тц метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деинизированной воды растворяют последовательно 15 мкмдесятикратного буферного раствора (0.8 М

50 трис-НС!, рН 7.4; 0,1 M MgClg); 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 MM каждого за исключением

Н"-тимидинтрифосфата)," 5 MKfl Д1-IK-азы-1

55 (концентрация 1 мкr/Iëë), 10 мкл Н-тимиз динтрифосфата (удельная активность 114

Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), мкл ДНКполимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл), Объем реакционной смеси составляет 150 мкл.

Реацию ведут в течение 20 — 40 минут при

1792429

5

30

50

20 С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около

25х10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК, Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной

ДНК альфа-Ri-7 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 секунд в 0,07Н NaOH с последующей промывкой по 10 минут в 70 и 96%-ном этиловом спирте. Препараты радиоактивных образцов ДНК денэтурируют в гибридизэционной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2xSSC), в течение 10 минут при 100 С. Гибридизацию проводят при 37 С в течение 17-18 часов.

Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2xSSC при

37 С, в двух сменах 2xSSC при комнатной температуре, в 70-96%-ном этиловом спирте по 15 минут в каждой смене, После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа M и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловом проявителем в течение 2 минут препараты тщательно промыват проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 M фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 минут. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при yeenweнии 10000 vlflH 1 125".

Гибридизация 1п situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа-Rl 7 локализуется только в прицентромерном районе 1-ой пары гомопоглчных хромосом человека и является таклм образом специфическим молекулярнь1м маркером данной пары хромосом. специфически маркирующим околоцентромерный район.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 1-й хромосомы в тех случаях, когда этэ хромосома (один из гомологов данной пары) затронута перестройкой, т.е, имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 1-й хромосомы и ее форме, Все процедуры по выделению образца

ДНК альфа-R1 -7 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а. также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора носителя сбалансированной транслокации (переноса) 3/4 части длинного плеча 1-й хромосомы на конец длинного плеча 17-й хромосомы, В результате такой транслокации длинное плечо 1-й хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафаэной пластинки с данной перестройкой под микроскопом диагностика данного нарушения (потери хромосомного материала) практически невозможна. Однако с помощью молекулярного маркера альфа-R1-7 для 1-й хромосомы гомологичный партнер.с укороченным длинным плечом в этой паре и потеря хромосомного материала в нем легко распознаются непосредственно под микроскопом.

Пример 3, Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера альфа-В1-7 для 1-й хромосомы является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер, Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая

Х-хромосома, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца полового хроматина, образованного одной из двух Х-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, B интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера альфа-R1-7, специфически маркирующего только 1-ю хромосому человека, наличие данной хромосомы в клеточном ядре можно устанавливать беэ приготовления препаратов метафаэных хромосом, а лишь по анализу иэображения интерфазных ядер, Это обусловлено тем, что образец ДНК альфа-R1-7 гибридизуется с ДНК прицентромерной области 1-й хромосомы и в том случае, когда эта хромосома находится в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае s каждом интерфазном ядре можно видеть,после гибридизации и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по размеру скопления (кластеров) зерен серебра (сигналов изотопной метки). В редких случаях можно видеть в интерфазном ядре одно крупное скопление зерен метки, если гомологичные хромо-

1792429

Составитель В.Серебряный

Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева едактор аказ 170 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 . нно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 с мы расположены очень близко друг от друга, i . .Все процедуры по выделению образца алнфа-Я1-7 и его обработки с изотолной еткой длн гибридизации на интерфазных я рах, а также все процедуры по приготовл нию препаратов метафазных хромосом ериферической крови и проведению гибидизации на хромосомах повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в римерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре бнаруживаются два скопления гранул мет(два кластера), соответствующих двум гоологичным хромосомам 1-й пары. В разных ядрах расстояния между кластерами раэличы. Таким образом, появляется реальная возожность непосредственно в интерфазных драх анализировать расположение гомолог чных партнеров конкретной пары хромо ом в клетках человека, что представляет — ольшой научный интерес с точки зрения ункциональной организации наследственых структур человека.

Таким образом, клонированная послеовательность ДНК альфа-R1-7 из генома еловека является эффективным инструентом для распознавания 1-й хромосомы еловека кэк в стандартных (после культивиования клеток) препаратах нормальных ромосомных наборов или в случаях с перетройками 1-й хромосомы. так и в цитологических (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клиниче5 ской генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 1-й хромосомы человека. а также при анализе анеуплоидий по хромосоме I при различных формах рака.

10 Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.

Формула изобретения

Рекомбинэнтная плазмидная ДНК альфа-R1-7, предназначенная для маркирования t-ой хромосомы человека, размером

20 4,98 т.п.о., содержащая: -EcoRI-ЕсоИ-фрагмент ДНК вектора pBR325 размером 4,3 "> т,п.о., -EcoRI-EcoRI-фрагмент ДНК центромерного района I-ой хромосомы человека размером 0,68 т.п.о.. состоящий из четырех

25 тандемно расположенных BspRI-повторов альфоидной ДНК человека размером 0,17 т.п.о. каждый, уникальные сэйты рестрикции: четыре BspRI сайта. два EcoRI сайта, генетические маркеры: Amp — ген устойчи30 вости к ампициллину.