Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент протективных моноклональных антител к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей

 

. Использование: биотехнология, иммунология . Сущность изобретения: штамм гибридных перевиваемых клеток был получен слиянием клеток мышиной миеломы P3NS1/1-Ag4.1 с клетками сйнгенных мышей BALB/c, иммунизированных очищенным препаратом вируса, южный вариант. Гибридома секретирует моноклональные антитела lgG2, специфически взаимодействующие с гликопротеином Е2 вируса ВсЭЛ, нейтрализующие инфекционность вируса на кул ьте клеток Vero с титром 1:200 и защищающие чувствительных животных от летательных доз вируса при пассивном введении. Штамм обозначен 1В2 и хранится под номером (И) 479Д, Титр антител достигает 1:5000 в культуральной жидкости и 1:300000 в асцитной. 1 табл., 1 ил. ел с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4874821/13 (22) 10.07,90 (46) 28.02,93, Бюл. N. 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения

"Вектор" (72) А,В,Перебоев, Е.В,Агапов, В.А.Святченко и В.Б,Локтев (56) Авторское свидетельство СССР

N 1671688, кл. С 12 N 5/00, 1989, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L-ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

ВИРУСУ ВОСТОЧНОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к медицинской вирусологии, и касается получения моноклональных антител к вирусу Восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), которые могут быть использованы для лечения и профилактики в медицине и ветеринарии.

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, секретирующих

МКА. способных эффектно защищать чувствительных животных при введении летальных доз вируса ВсЭЛ, что делает препараты данных антител перспективными в качестве среДств профилактики и лечения тяжелого вирусного заболевания, "„Зто достигается слиянием клеток мышиной миеломы РЗ NS1/1-Ag4.1 с клетками селезенки мышей BALB/с, иммунизированных очищенным вирусом ВсЭЛ.

„, Ы „„1798372 Al (57} Использование: биотехнология, иммунология, Сущность изобретения: штамм гибридных перевиваемых клеток был получен слиянием клеток мышиной миеломы

P3NS1/1 — Ag4.1 с клетками сингенных мышей BALB/с, иммунизированных очищенным препаратом вируса, южный вариант.

Гибридома секретирует моноклональные антитела tgG2, специфически взаимодействующие с гликопротеином Е2 вируса ВсЭЛ, нейтрал иэующие инфекцион ность вируса на культе клеток Чего с титром 1:200 и защищающие чувствительных животных от летательных доз вируса при пассивном . введении, Штамм обозначен 1Â2 и хранится под номером (И) 479Д, Титр антител достигает 1:5000 в к льт альной жи кости и у ур д

1;300000 в асцитной. 1 табл., 1 ил, Штамм получают следующим образом.

Для иммунизации используют самок мышей BALB/с, Схема иммунизации включает внутрибрюшинное введение препарата вируса ВсЭЛ трехкратно в дозе 50 мкг на мышь с интервалом в 2 недели с полным адъювантом Фрейнда. За 3 суток до слияния животным вводят 50 мкг вируса внутривенно в физрастворе. Мышей забивают с помощью хлороформа и в стерильных условиях извлекают селезенки, из которых готовят клеточную суспензию, В качестве партнера для слияния используют 400 млн селезеночных клеток и 80 мл клеток М31. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,5 мл 50;ь раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 2000.

1798372

Смесь центрифугируют 4 мин при 600

g. Через 8 мин слой ПЭГ медленно разбавляют раствором Версена, после чего осадок ресуспендируют и центрифугируют. Клетки распределяют в 10 культуральных микроплат. Селекция гибридных клеток проводят в среде НАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ (M), в которую добавлены 20,(, фетальной сыворотки коров, 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0;01 мМ аминоптерина.

Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа, используя в качестве антигена 200 нг очищенного вируса .ВсЭЛ. Гибридому 182 дважды клонируют методом предельных разведений, переводят в массовую культуру и эамора>кивают в жидком азоте.

Штамм гибридных клеток депонирован в коллекции Института цитологии АН СССР.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой NS1. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Культуральные свойства. Среда для культивирования — среда ДМЕМ (производство В Н И И М Б), содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ

НЕРЕЯ (ДМЕМ (M)). Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде 157. В среду также добавляют 1 мкг/мл сульфата гентамицина, Гибридома 1Â2 растет в виде монослойно-суспензионной культуры. Посевная доза 100-200 тыс. клеток в миллилитре, кратность рассева — 1:3-1:4.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самок мышей BALB/c сенсибилизируют внутрибрюшинным введением

0,5 мл пристана. Через 2-4 недели животным вводят 5 млн гибридных клеток. Через

10-12 дней формируется асцитная опухоль.

От одного животного можно получить 3-5 мл асцитической жидкости. Гибридома прививается в 100 (, случаев.

Характеристика полезного продукта;

MKA относятся к субклассу (962з. Они специфически взаимодействуют с гликопротеином Е2 вируса ВсЭЛ в реакции иммуноблотинга. Активность MKA в реакции нейтрализации вируса ВсЭЛ на культуре клеток Чего составляет 1:200. MKA 1В2 эффективно защищают мышей от введения летальной дозы вируса ВсЭЛ. Индекс разистентности составляет 6,5 Ig. Титр MKA в

ИФА составляет 1:5000 для культуральной жидкости и 1:300000 для асцита. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 30 пассажей in vitro.

Криоконсервирование. Среда для замораживания — среда ДМЕМ(М) — 507;, фетальная сыворотка — 40 (,, диметилсульфоксид—

10, 0,5 мл клеточной суспензии переносят

s пластиковые криопробирки и помещают в

10 пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см, Контейнер вносят в пары жидкого азота. Через сутки пробирки переносят в жидкий азот. Раз мо ражи ва н ие и ров одят, опуская пробирки в воду с температурой 41

С. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют при 600 g. Осадок ресуспендируют в ростовой среде в концентрации

200 — 300 тыс. клеток в миллилитре и переносят в культуральные флаконы. Жизнеспо20 собность после размораживания составляет

60 — 80 f, (окраска 0.257 трипановым синим).

Изобретение иллюстрируется чертежом.

Иммуноблотинг очищенного в градиен25 те плотности сахароэы вируса ВсЭЛ. После электропереноса вирусных белков полоски нитроцеллюлозы обрабатывали 0,57-ным раствором казеина. После .насыщения мест неспецифического связывания, поло30 ски инкубировали в 2 мл культуральной среды соответствующей гибридомы. Места связывания МКА определяли при помощи меченых пероксидазой антител против иммуноглобулинов мыши. 1 — культуральная

35 среда гибридомы 1В2; 2, 3 — отрицательные контроли с нормальной мышиной сыворот.кой, культуральной средой мышиной миело. мы NS1, 4 — смесь трех видов МКА к белкам

Е1, Е2 и С вируса ВсЭЛ (9F2, 10G8, 1В11).

40 Пример 1, Определение вирусного белка, специфически реагирующего с МКА, синтезируемыми гибридомой 1В2, Вирусный белок-мишень для МКА 1В2 определяют методом иммуноблотинга. Бел45 ки вируса ВсЭЛ, разделенные электрофореэом в полиакриламидном геле переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Mllllpore, CLUA) по методу Roehrig et aL Перенос проводят в течение 1,5 часов на аппарате

50 Transphor (KLB, Швеция) при напряжении

80 в 0,025 Мтр,ис-HCI буфере, содержащем . 0,192 М. глицина (рН 8,3) и 20% этанола.

Контроль переноса белков на нитроцеллю-. лозе осуществляют прокрашиванием поло55 ски мембраны амидочерным 108.

Остальные полоски помещают в 10 мМ трисHCl буфер рН 7,2, содержащий 0,145 м NaCi, 0,05 0 твин 20(ТВЗ-твин) и 0,5/ казеина на ночь при 4 C. Обработанные таким образом полоски инкубируют в течение часа при 37

1798372

Протективная активность MKA 1 В2 от летальной инфекции вирусов ВсЭЛ при пассивной иммунизации белых мышей, С с препаратами асцитической жидкости

МКА в разведении 1:100, От избытка антител избавляются трехкратным промыванием мембран ТВС-твин. Далее мембраны обрабатывают кроличьей анти- 5 сывороткой к мышиным lgG, меченой пероксидазой в разведении 1:200. Выдерживают

2 часа при комнатной температуре. Полоски . промывают И проявляют в растворе хромогена, содержащем 1 мг/мл 4-хлор-1-нафто- 10 ла и..0.03; перекиси водорода в 50 мМ трис-НО буфере рН 7,4 и 0,145 MNaCI. Взаимодействие МКА с вирусными белкам про- являются в виде ярких сине-фиолетовых полос, flo данным иммуноблотинга MKA 15

1В2 взаимодействуют гликопротеиномЕ2 (55 кД) вируса ВсЭЛ (см. чертеж).

- Пример 2 Определение протективной активности МКА1В2 от летальной инфекции . ВсЭЛ при пассивном введении. 20

Для определения протективной актив-. ности MKA 1B2 использовали две группы беспородных белых мышей весом 8 — 10 r.

Одной группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1мл асцитической жидкости, со- 25 держащей МКА 1В2, другой, используемой в качестве контрольной; вводилйасцитическую жидкость, содержащую MKA гибридомы 7В6 (прототип), не обладающие протективным эффектом, Через сутки после 30 введения MKA животных подкожно инфицировали различными дозами вируса ВсЭЛ с 10-кратным шагом разведений. Наблюдение за животными проводили в течение 10 дней; Протективную активность МКА выражали через индекс резистентности, который представляет собой разность логарифмов титров вируса, определенных на животных, пассивно иммунизированных исследуемыми и контрольными МКА. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера. Результаты эксперимента представлены в таблице.

Таким образом, полученный на основе мышиной миеломы штамм гибридных клеток 1Â2 продуцирует протективные МКА, которые могут использоваться в качестве средств профилактики и лечения. Данные

MKA в дозе 1-2 мг защищают белых мышей от- более чем 3 млн LD5o вируса ВсЭЛ. Данные MKA относятся к IgG2a субклассу.

Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток 1В2 позволяют заключить, что впервые получена гибридома, синтезирующая протективные МКА к вирусу

Всэл.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus museulus L ВСКК (II) М

479 — продуцент flpoYGKòèâíûõ моноклональных антител к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей, 1798372

Составитель А.Перебоев

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор М.Керецман

Редактор С.Ходакова

Заказ 752 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101