Способ определения антител в сыворотке крови

 

Использование: в области биохимии и иммунологии. Сущность, изобретения: в сыворотку крови норок добавляют коньюгат хлорофоса с денатурированной дезоксорибонуклеиновой кислотой, после перемешивания в течение 15 мин вводят стандартный раствор специфичного субстрата холинэстеразы - бутирилтиохолиниодидэ и опускают ферментный электрод с иммобилизованной в пленке из нитрата целлюлозы холинэстеразой, регистрируют осцилловольтамперограмму в интервале (-0,1) - (-0,8) В, а концентрацию специфичных антител определяют по высоте пика при потенциале -0,55 ± 0,05 В.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕНЮЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4902268/14 (22) 14.01.91 (46) 07.08.93. Бюл. N. 29 (71) Казанский государственный университет им. B.È.Óëüÿíîâà-Ленина (72) С.С.Бабкина, Э.П.Медянцева, Г.К.Будников, М.Г.Вертлиб, Н.Н.Ибрагимова и

В,Г. Винтер (56) Clin. Chem„1980, ч.26, р.1723 — 1726. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В

СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Использование: в области биохимии и иммунологии. Сущность, изобретения: в сыПредлагаемое изобретение относится к области биохимии и иммунологии, может найти применение в ветеринарии и медицине для диагностики различных заболеваний.

Цель изобретения — упрощение способа определения антител, Расширяется также круг определяемых веществ.

Поставленная цель достигается тем, что в исследуемый раствор, содержащий анализируемую сыворотку крови, добавляли коньюгат хлорофоса с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой, после перемешивания в течение 15 минут вводили стандартный раствор специфичного субстрата бутирилхолинэстеразы (бутирилХЭ)— бутирилтиохолиниодида (БТХИ) и опускали ферментный электрод на основе иммобилизованной путем включения в пленку из нитрата целлюлозы холинзстеразы, регистрировали осцилловольтамперограмму в интервале потенциалов (-0,1) — (-0,8) В, а концентрацию специфических АТ определяли по высоте пика при потенциале -0,55 +. 0,05

В.,, Я2„„1832198 А1 воротку крови норок добавляют коньюгат хлорофоса с денатурированной дезоксорибонуклеиновой кислотой, после перемешивания в течение 15 мин вводят стандартный раствор специфичного субстрата холинэстеразы — бутирилтиохолиниодида и опускают ферментный электрод с иммобилиэованной в пленке из нитрата целлюлозы холинэстеразой, регистрируют осцилловольтамперограмму в интервале (-0,1) — (-0,8) В, а концентрацию специфичных антител определя- ют по высоте пика при потенциале-0,55 0,05 В.

В предлагаемом способе определения

AT в качестве антигена использована денатурированная однониточная дезоксирибонуклеиновая кислота (д-ДНК), которая специфична к аутоантителам, наличие которых в сыворотке крови больного организма характерно для целого ряда аутоиммунных заболеваний.

Пример 1. Получение коньюгата (хлорофос — д — ДНК). Для получения коньюгата 0,0004 r хлорофоса растворяли в 2 мл раствора д-ДНК с концентрацией 0,1 мг/мл (раствор ДНК селезенки крупного рогатого скота в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) денатурировали кипячением на водяной бане в течение 20 минут с последующим резким охлаждением). После перемешивания в течение 15 минут добавляли

0,06 мл 25%-ного глутарового альдегида марки "Реанал". Полученный раствор перемешивали 15 мин, Наилучшими свойствами обладает конаюгат следующего состава (мас.%):

1832198

0,0094-0,0096

0,018 — 0,019

4,29 — 4,30

Предлагаемый способ определения AT с использованием ингибиторного ИФА был применен для диагностики одного из опасных аутоиммунных заболеваний- алеутской болезни норок, которая характеризуется резким повышением уровня иммуноглобуд — ДНК

Хлорофос

Глутаровый альдегид

Карбонатный буфер с рН 9,6 Остальное

Для многократного использования дорогостоящего фермента бутирилХЭ использован разработанный нами ранее ферментный электрод на основе холинэстераэы иммобилизованной в пленке из нитрата целл юлоз ы (А.с. N. 1296913).

Использование в данном случае ферментного электрода значительно упрощает проведение ИФАМ, обеспечивает возможность

его автоматизации, а также позволяет одновременно проводить высокочувствительную детекцию продукта ферментативного гидролиза специфического субстрата ХЭ—

БТХИ. Продукт — тиол — образует меркаптид ртути, который восстанавливается на стационарном ртутно-пленочном электроде с серебряной подложкой (СРПЭ), На осцилловольтамперограммах БТХИ на

СРПЭ с серебряной подложкой наблюдается небольшой пик при потенциале -0,55 В относительно насыщенного каломельного электрода, который быстро растет по высоте в присутствии ХЭ. При введении в исследуемый раствор конъюгата, содержащего ингибитор (хлорофос), высота пика уменьшается и зависит от концентрации ингибитора в ячейке, которая, в свою очередь, зависит от степени прохождения иммунологической реакции.

При отсутствии в исследуемом растворе специфических AT конъюгат, содержащий ингибитор, свободно подходит к активным центрам ХЭ и взаимодействует с ними, мешая подходу субстрата, т.е. оказывает обычное ингибирующее действие, что отражается на уменьшении высоты катодного пика при потенциале -0.55 В по сравнению с током пика, зарегистрированным в отсутствие конъюгата. При наличии же в растворе специфических AT благодаря перемешиванию происходит быстрое связывание специфических AT с д-ДНК конъюгата. Так как антитела являются биологическими макромолекулами, то, находясь в иммунном комплексе, они стерически закрывают ингибитор ХЭ, и он не может подойти к активным центрам фермента. Высота пика в данном случае не изменяется. линов. Диагностику осуществляют следующим образом.

Пример 2. Получение контрольного сигнала. Биосенсорную часть ферментного электрода помещают на 30 минут при комнатной температуре в 1ф>-ный раствор бычьего сывороточного альбумина в фосфатном буфере(рН 7,4)для предотвращения неспецифического связывания AT. После

10 промывки боратным буферным раствором с рН 9,05 ферментный электрод вводят в электрохимическую ячейку с насыщенным каломельным электродом (нас;к.э.), вводят 4,5 мл боратного буферного раствора (pH 9,05) и

15 0 5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 1,9 10 моль/л. Удаляют кислород в течение 15 минут током водорода и снимают осцилловольтамперограммы в интервале потенциалов (-01) — (-0,8) В, U = 1

20 В/с, в непрерывном режиме поляризации с треугольной разверткой потенциала. Измеряют высоту катодного пика при потенциале

Ел — 0,55 В, Пример 3. Получение аналитического

25 сигнала в присутствии конъюгата и сыворотки здоровых норок. В электролитическую ячейку с нас.к.э. вводят 4,3 мл боратного буфера (рН 9,05), добавляют 0,2 мл конъюгата и 6 мкл сыворотки здоровых норок. После

30 перемешивания в течение 15 мин добавляют 0,5 мл стандартного раствора БТХИ с концентрацией 1,9 10 моль/л и опускают ферментный электрод. Все дальнейшие операции проводят как описано выше.

П.р и м е р 4. Построение зависимости величины тока пика от концентрации AT, В электролитическую ячейку с нас.к.з, вводят

4,3 мл боратного буфера с рН 9,05, добавляют 0,2 мл конъюгата и от 1 до 10 мкл— глобулиновой фракции с концентрацией 15 мгlмл, полученной из сыворотки больных норок. После перемешивания в течение 15 мин добавляют 0,5 мл стандартного оаствора БТХИ с концентрацией 1,9 10 моль/л

45 и опускают ферментный электрод. Удаляют кислород в течение 15 мин током водорода или аргона и снимают осцилловольтамперограмму в интервале потенциалов от (-0,1) до (-0,8) в (0-1 В/с, Е -0,1 В, непрерывный

50 режим поляризации, треугольная развертка потенциала), Измеряют высоту катодного пика при потенциале -0,55 В. Строят зависимость высоты катодного пика от концентрации AT. Вид этой зависимости представлен на рисунке. Линейная часть зависимости в интервале концентраций от

10 до 10 М в присутствии конъюгата (хлорофос — д-ДНК) может быть использована как градуировочный график для количест1832198 венного определения AT, что позволяет оценить тяжесть заболевания.

Результаты определения специфических AT представлены в таблице.

Пример 5. Получение аналитического 5 сигнала в присутствии сыворотки крови норок с неизвестным содержанием специфических антител. В электролитическую ячейку с нас.к.э, вводят 4,3 мл боратного. буфера с рН 9,05, добавляют 0,2 мл конъю- 10 гата и 6 мкл анализируемой сыворотки. Все дальнейшие операции проводят как описано выше.

Результаты определений могут быть представлены также по положительно-от- 15 рицательному методу. Диагностику проводили по разнице величины пиков при потенциале -0,55 В в отсутствие и в присутствии анализируемой сыворотки животных.

Эта разница в величинах сигналов составля- 20 ет не менее 2 — 3 величин стандартного отклонения величины пиков при потенциале -0,55 В в присутствии сыворотки здоровых животных (нулевого стандарта).

Стандартное отклонение составляет в на- 25 ших условиях 0,1 мкА для n=5. Общее время анализа составляет 1 ч 15 мин.

При проведении серийной диагностики для последующих определений нет необходимости получения контрольного сигнала и 30 сигнала в присутствии сыворотки здоровых норок. Время анализа в данном случае составляет 30 мин.

Для многократного использования ХЭ и возможности автоматизации процесса ди- 35 агностики разработаны условия реактивации биосенсорной части .ферментного электрода, заингибированной под действием хлорофоса в составе конъюгата. При выдерживании ее в 2 10 М растворе 40 гидроксиламина в течение 10 мин ферментативная активность (высота пика) возвращается к исходному уровню, Результаты по диагностике заболеваний, полученные с помощью предлагаемого 45 способа, хорошо согласуются с результатами классического ИФА со спектрофотометрической индикацией.

Селективность способа установлена при введении в систему иммуноглобулина С 50 крупного рогатого скота и лошади, в присутствии которых наблюдается обычный спад тока пика при -0,55 В, как и в случае наличия в анализируемом растворе одного конъюгата беэ специфических AT.

Чувствительность поедлагаемого спо.соба составляет 2,0 10 M специфических антител. Ошибка определения составляет менее 47; (в известном способе менее 5 ), Отклик электрода наступает практически мгновенно, что позволяет использовать его в режиме датчика по типу "красный-зеленый" (т.е. присутствуют AT или отсутствуют).

Предлагаемый способ определения AT позволяет проводить диагностику ряда аутоиммунных заболеваний с высокой чувствительностью и селективностью, испольэовать ХЭ многократно. Работа в кинетическом режиме при перемешивании позволяет сократить время анализа от нескольких часов до 30.мин в случае серийных оп ределений..Возможно также проведение анализа образцов, содержащих примеси крови, поскольку в их присутствии не наблюдается изменение контрольного сигнала.

Формула изобретения

Способ определения антител в сыворотке крови путем внесения в ячейку конъюгата модулятора фермента с антигеном, исследуемого образца, фермента, перемешивания смеси, добавления субстрата с последующей регистрацией и расчетом концентрации антител, отл и чаю щий ся тем,что, с целью упрощения способа при определении аутоиммунных антител в сыворотке крови норок, в качестве конъюгата модулятора фермента с антигеном используют конъюгат хлорофоса с денатурированной ДН К, в качестве фермента — бутирилхолинэстеразу, в качестве субстрата — бутирилтиохолиниодид, перемешивание смеси проводят в течение 15 мин до внесения субстрата, регистрацию осуществляютс помощьюферментного электрода, при потенциале 0,55 +

+ 0,05 В осцилловольтамперограммы записывают в интервале потенциалов (-0,1) — (-0,8)

В, а концентрацию антител рассчитывают по высоте пика.