Способ разделения белков крови

 

союз сОВетских сОциАлистических

РЕСГ1УВЛИК (Я)5 А 61 К 35/16

Г СУДАРСТВЕННЮЕ ПАТЕНТНОЕ

В ДОМСТВО СССР (Г ЭСПАТЕНТ СССР) ма9ВЖЬ;„ фпИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К,,ПАТЕНТУ да и фибронектина

1) 4743107/14

6) РСТ/FR 89/00050 (08.02.89)

2) 06.02.90

1) 8807530

2) 07.06,88

3) FR

63 30.08.93. Бюл, ¹ 32

1) Сантр Рекиональ де Трансфюэьон Санн де Лилль (FR)

2) Тьерри Бюрнуф и Марианна Бюрнуф

R)

6) Thrombosis Research., 1987, Suppl. Vll, . 60.

4) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ КРОИ

7) Изобретение относится к процессу разеления белков из фракции плазмы крови (Изобретение относится к разделению елков во фракциях плазмы крови человека

1 животных посредством анионообменной роматографии с использованием методии, обеспечивающей высокоэффективную дностадийную очистку, особенно фактора

III, фибриногена и фактора фон Виллебанда.

С целью получения фракции высокомоекулярного материала, содержащего факор Vill: .С в комбинации с фактором фон иллебранда (комплекс, частично очищеный от фибриногена), предлагалось испольовать стерео-селективную хроматографию ли гель-фильтрацию. Эти методики позвояют получать, хотя и с небольшим выходом, продукт. специфическая активность которого не превышает 30 международных единиц на мг и для стабилизации которого требуется добавление альбумина (что приводит к

„„. ЖÄÄ 1837880 АЗ человека или животных. Сущность изобретения: фракцию криопреципитата плазмы подвергают одностадийной хроматографии на анионно-обменной смоле относительно умеренной ионной силы, обеспечивающей гидрофобные взаимодействия, которая не адсорбирует определенные белки, но фиксирует другие белки, которые затем аллируются с увеличением ионной силы буферного раствора добавлением в него хлористого натрия, Способ позволяет, в частности, получать высокоочищенный концентрат фактора Vill, который можно испольэовать при лечении гемофилии А.

Способ позволяет также получать концентраты фибриногена, фактора фон Биллебрануменьшению специфической активности примерно до 3 — 5 международных единиц на мг). При таком подходе возникают трудности, связанные с адаптацией методики к условиям крупномасштабного производства и необходимостью поддержания высокой разрешающей способно ги промышленных гель-фильтрационных колонок на протяжении известного периода.

Концентраты фактора VIII получают также посредством включения в технологическую схему стадии адсорбции на микрогранулах пористого диоксида кремния с целью очистки от низкомолекулярных белковых примесей (Vox Sanq., 46, 341-348, 1984). Специфическая активное ь продукта при этом относительно невелика (1 международная единица на мг).

В последнее время появились новые методы получения BblcoKooчищенных концент1837880 ратов фактора Ч1И. Так, например, компании Хиланд и Травенол предложили способ получения концентратов с помощью иммуноафинной хроматографии (Thrombosis

Res., Suppl., Vll, стр. 58, 1987; Thrombosis

Res., Suppl., Vill, стр, 60, 1987; Thrombosis

Res., Suppl. Vll). В соответствии с этим методом фактор

ЧИ! очищают на антителах к фактору ЧИ1: С или фактору фон Виллебранда, иммобилиэован н ых на хроматографической среде.

Этот способ дает хорошие результаты, но требует применения высокоактивных растворителей на стадии десорбции фактора

Ч1И со специфических антител или с антител 15 к фактору фон Виллебранда. В связи с этим необходима дополнительная процедура ультрафильтрации, с помощью которой удаляются нежелательные химические агенты, что может отрицательно сказываться на би- 20 ологической активности фактора Ч1И, Специфическая активность этого фактора в процессе производства может достигать

1000 международных единиц на мг и даже

3000 международных единиц на мг, однако 25 его нестабильность заставляет применять стабилизаторы, например альбумин, на стадии, предшествующей лиофильной сушке, что вызывает снижение специфической активности до 3 — 5 международных единиц на 30 мг; Тем не менее, основным недостатком методики получения фактора Ч!И методом иммунного средства является присутствие в препарате остаточных антител, Поскольку последние получают иммунизацией мышей, они могут вызывать у больных иммунные реакции, как при введении любых инородных для организма белков.

Использовалась также ионообменная хроматография, однако сфера ее примене- 40 ния ограничивается лабораторными экспериментами в связи с технической сложностью этой методики и низким выходом конечного продукта.

В работе Дж. Дж. Моргенталлера. 45 (Thromb. Haemostas, Stutgart, 47 (2), 124127, 1982) обсуждается, например, способ очистки фактора ЧИ1: С с использованием хроматографии полиэтиленгликольного преципитата на модифицированной сефа- 50 розе. Однако, указания на показатели выхода продукта и воспроизводимость результатов при использовании различных подходов отсутствуют.

Таким образом, представляется совершенно необходимой разработка новых методов получения (больших) белковых концентратов, в частности фактора Vill, которые можно было бы внедрить в промышленное производство с целью достижения высокого выхода продуктов, IloflHOGTblo свободных от посторонних белков, таких как антитела животного происхождения.

Заявитель предлагает процесс очистки на основе анионообменной хроматографии, который позволяет, благодаря правильному подбору смолы, отделять искомый белок на одной хроматографической колонне при условиях, устраняющих необходимость последующей обработки, например ультрафильтрация, Это предотвращает усложнение процесса и снижение специфической активности очищенного белка.

Таким образом, изобретение относится к процессу очистки белков плазмы крови, конкретно — фактора Vill, фибриногена, фибронектина и фактора фон Виллебранда, отличающемуся тем, что солюбилизированная фракция криопреципитата плазмы человека подвергается хроматографии на анионообменной смоле относительно умеренной ионной силы, обеспечивающей гидрофобные взаимодействия, но не адсорбирующей определенные белки, фиксированные на смоле белки специфически элюируются при увеличении ионной силы буферного раствора, Это процесс пригоден также для работы с плазмой крови животных, например свиней, что необходимо в некоторых случаях гемофилии у больных, сыворотки которых обладают ингибирующими свойствами и для лечения которых нельзя использовать человеческий фактор ИП.

В качестве исходной фракции можно использовать фракцию криопреципитата плазмы, в том числе подвергавшуюся предварител,ьной обработке перед процедурой очистки, Такая обработка может заключаться, например, в осаждении окисью алюминия и/или в низкотемпературной и реципитации обычными методами, применяемыми для обработки таких фракций.

При тестировании различных смол на эффективность хроматографического разделения установлено, что наилучшие результаты достигаются применением смол, в которых ДЭАЭ - группировки фиксированы на винил-полимерном геле, например фрактогеле ТСК, Смола такого типа поступает на рынок под названием фрактогель

ТСК - ДЭАЭ 650 (М) (фирма Мерк), Основанная на неи хроматографическая система дает намного лучшие результаты чем системы на основе других типов гелей, таких как

ДЭАЭ - сефароза ЦЛ - 6Б, ДЭАЭ - сефароэа

ЦЛ - 6Б (Fast — Flow) фирмы Фармация, ДЭАЭ вЂ” сефароза 4Б или ДЭАЭ - трисакрил ЛС фирмы ИБФ.

1837880 л к м ч р т к и о в л

Ф

К с

Применение геля. подобного фрактогеТСК-ДЭАЭ (М), описано Като с соавтора(J, Chromatog., 245, 1982, 193 — 211), торые рекомендуют его в качестве систеI со средней эффективностью для коммерского разделения белков очень крупного змера, Емкость удержания и элюции мариала на таком геле определяются его упнопористой структурой и пониженной нообменной способностью.

Заявитель установил, что такой тип геля еспечивает воэможность преимущестнной адсорбции крупноразмерных компксов, образующихся при взаимодействии ктора Vill и фактора фон Виллебранда. оме того, посредством подбора соответвующих уравновешивающих и элюируюих буферных растворов, заявитель казал возможность использования слабодрофобных связей, образующихся в рельтате длительной задержки крупноразрных комплексов на поливинильном геле. ти преимущества описываемого геля рае не отмечались.

Используя такую смолу для работы с ракцией плазмы, содержащей фактор ЧИ1, пример, предварительно очищенный расор криопреципитата, а также соответствущие буферные растворы, получают нцентрат фактора Vill очень высокой стеени очистки с характеристиками, свойстнными концентрату плазмы одной группы ови. Содержание фактора Vill в таких преаратах составляет 50 международных едииц на мл при специфической активности выше 200 международных единиц на мг, ни не требуют ультрафильтрации, характеизуются высокой стабильностью и позволят отказаться от добавления стабилизаторов елковой природы, С помощью той же хроатографической системы можно также олучать фракции, обогащенные фибриноном, фибронектином или фактором фон иллебранда, с физико-химическими свойтвами, удовлетворяющими требованиям линического применения или использоания в качестве реагентов, Кроме того, ибриноген может быть подвергнут дальейшему концентрированию для использоания в качестве биологического клея, в оответствии с заявкой на Европейский паент N 88401961.3.

Способ осуществляется следующим обазом.

Предварительно очищенную фракцию лазмы крови, содержащую основные бели криопреципитата, т,е. фибриноген, факор Vill, фибронектин и фактор фон иллебранда, пропускают через вышеопианную анионообменную смолу. Фактор

Vill, фактор фор Виллебранда и фибронектин (первые два фактора полностью или большая их часть, в зависимости от количества исходного материала) адсорбируются на смоле, тогда как фибриноген обнаруживают в фильтрате неадсорбируемых белков.

При первом повышении ионной силы буферного раствора элюируются фибронектин и значительная часть фактора фон Виллебранда.

Дополнительное увеличение ионной силы буфера приводит к элюции фактора Vill вместе с небольшими количествами фактора фон Виллебранда. Эту фракцию можно сразу подвергать лиофильной сушке, не добавляя в нее стабилизаторы и не подвергая ультрафильтрации.

Наилучшие результаты дают использование буферного раствора, содержащего лизин в концентрациях от 2 до 4 г/л или глицин в концентрациях от 8 до 11 г/л, Применение других аминокислот или только одной из двух указанных аминокислот дает значительно менее эффективные результаты.

Ионную силу буфера повышают добавлением хлористого натрия. Применение вышеуказанной смолы, характеризующейся умеренной ионной силой и слабой гидрофобностью, дает возмо кность использовать эту соль для десорции фактора фон

Виллебранда раньше фактора Vill и позволяет отказаться от хлористого кальция, который приходится впоследствии удалять ультрафильтрацией для диссоциации факторов Vill: С и фон Виллебранда.

Обработка с целью инактивации вирусов одним из существующих методов может, разумеется, производиться на любой стадии процесса. При использовании химического антивирусного средства инактивацию лучше всего проводить до пропускания фракции плазмы через смолу. В этом случае хроматографический процесс обеспечивает эффективное удаление инакгивирующих соединений.

Хорошие результаты получены при использовании растворов детергентов для инактивации вирусов, как описано в Европейской патентной заявке N 0131740.

Фактор Vill ìoæåT быть получен посредством хроматографии любой содержащей его белковой фракции, например, из предварительно очищенного криопреципитата плазмы. наносившейся на окись алюминия с последующим осаждением при низкой температуре, в соответствии с общепринятыми способами изготовления концентрагов факторов Vill, как описано в Е:ропейской патентной заявке N". 861042976.

1837880 ной А!(ОН)з на кг криопреципитата при комнатной температуре и непрерывном помешивании в течение 5 мин. рН доводят 0,1 M уксусной кислотой до 6,5-6,6. Затем суспензию охлаждают до 14 — 16 С, и родоп жают перемешивание, По достижении укаэанной температуры производят центрифугирование, на осадочную фракцию собирают и подвергают стерилизации посредством фильтрования.

Такой предварительно очищенный раствор обрабатывают детергентом с целью инактивации вирусов, в присутствии твинаТНБП, в соответствии с описанием, привеСпецифическая активность фактора

Vill. С в исходной фракции может быть очень низкой (порядка 0,1 международной единицы на мг), Одностадийная анионообменная хроматография согласно данному способу обеспечивает его 400-700-кратную очистку. При этом выход составляет 75—

90$.

Полученный таким образом концентрат фактора VIII характеризуется очень высокой степенью очистки при специфической активности более 100 международных единиц на мг белка, Препарат не содержит фибриноген или иммуноглобулин Г и в значительной степени свободен от фибронектина. В нем отсутствуют также антитела к факторам группы крови или их содержание незначительно. В связи с этим его можно классифицировать, в соответствии с рекомендациями

Европейской Фармакопеи, как концентрат плазмы крови одной группы даже в случае использования в качестве исходного материала плазмы, отбиравшейся без учета группы крови. Благодаря этому, препарат может с успехом применяться в клинике, особенно для лечения гемофилии А. когда требуются многократные инъекции. Его можно испольэовать также в качестве реактива при любых тестах и анализах, требующих высокой степени очистки фактора

VI II.

Получаемые с той же хроматографической колонны другие фракции также представляют интерес с точки зрения своего белкового состава С с одной стороны, они содержат фибриноген, который выделяют из первичного фильтрата, а с другой стороны, фибронектин и фактор фон Виллебранда, которые элюируются после первого повышения ионной силы буферного раствора.

Способ иллюстрируется следующими примерами, которые не исчерпывают возможности его применения.

Пример 1. А. Предварительная очистка и инактивация вирусов.

В качестве исходного материала используют криопреципитат плазмы человеческой крови, ресуспендированный в водном растворе натронного гепарина (2 ед,/мл) и содержащий фактор Vill со специфической активностью от 0,6 до 1,1 международных единиц на мг. рН суспензии доводят до 7,0-7,1 добавлением 0,1 M уксусной кислоты.

10

15 денным в Европейской заявке на патент N

0131740.

Б. Хроматографическое разделение на фрактогеле ДЭАЭ-ТСК.

Иэ фрактогеля ТСК-ДЭАЭ 650 (М) фирмы Мерк готовят хроматографическую колонку из расчета 0,5 л фрактогеля на xr

20 криопреципитата. Колонку промывают 5 объемами 0,1 M раствора хлористого натрия и уравновешивают буферным раствором

30 следующего состава: лимоннокислый натрий (2,94 г/л), хлористый кальций (1 мМ), хлористый натрий (0,11 М), глицерин (9 г/л), лизин (3 г/л).

На колонку наносят предварительно очищенный, как описано в примере А, раствор криопреципитата, Получаемые фильтраты и элюаты анализируются на содержание белка по поглощению при 280 нм, которое в дальнейшем изложении выражается в единицах оптической плотности (О.П.).

Первый фильтрат показывает пик белкового материала,не адсорбирующего на колонке и состоящего в основном иэ

35 фибриногена (см. пример 3), После прохождения этого пика, когда

О.П. уменьшается до базовой величины, элюцию продолжают, используя тот же буфер, но более высокой ионной силы, которая достигается добавлением хлористого на40

45 трия до конечной концентрации 0,15 М

Этот буфер вызывает десорбцию белкового пика, содержащего основное количество фактора фон Виллебранда и фибронектина (см, пример 4), 50

После снятия этого пика и снижения

О.П. до базового уровня повторно увеличивают ионную силу буферного раствора, добавляя хлористый натрий до конечной концентрации 0,25 M.

При этих условиях фактор И11элюирует55

Полученную таким образом суспензию ся в концентрации порядка 30 — 40 международных единиц/мл, криопреципитата подвергают очистке на геле из окиси алюминия и осаждением при низкой температуре. Окись алюминия до- Пример 2. Получение концентрата бавляют в суспензию из расчета 108 г 2 $- фактора Vill.

1837880 мо

on до ко зов уль рас зуя ис мо ци де тв быс фа,к тяж

Ф ис то вь те ф к чае б л

50 натрий в концентрации 0,11 M при рН 7,0 и осмотическом давлении 387 мосМ, При этом условии достигается весьма эффективное удаление твина и ТНБФ.

Поскольку исходный раствор уже содерм т

Д ф б б л

55 жит фактор фон Виллебранда в очень высоБФ), кой концентрации, последний в значиОчистку содержащегося в этом in3Te- TBAbHQ большей степени задерживается на але фибриногена производят дополни- колонке чем во время хроматографирования ьной хроматографией на колонке иэ на первой колонке, Адсорбирующая способарин-сефарозы. ность атон колонки состааляет по краинеа т л г и

Раствор фактора Ч1!1, полученный с поью хроматографической процедуры, анной в примере 1, характеризуется аточно высокими степенью очистки и ентрацией, что позволяет сразу реалить его по флаконам без дополнительной рафильтрации.

При необходимости можно получать воры различной концентрации, испольдля разведения тот же буфер, который ольэовали для элюции. Таким образом но получать упаковки препарата со спеической активностью, соответствующей ствующим стандартам.

Усредненный состав получаемых расов представлен ниже: белки (г/л) 0,16 — 0,25 фактор Vill: Ñ (международные единицы) мл 30-45 специфическая активность фактора V 1 1 I; C (международные единицы) мг 120-250 фибриноген (г/л) менее 0,1 фактор фон Виллебранда (Ag, ед./мл) 11 — 23 фактор фон Виллебранда (RCO, ед.мл) 10 — 20 фактор Vill (Ag, ед./мл) 35-60 иммуноглобулины Г, мг/мл (нефелометрия) менее 0.011 природные и индуцированные анти - А - антитела 0 — 2 фибронектин (кг/л) 15 — 40

После лиофилизации получают чистый, трорастворимый продукт. Содержание тора Vill:С остается постоянным на проении суток при комнатной темг1ературе.

При инъекции людям восстановление ктора Vill:C сопоставимо с таковым при ользовании менее очищенных продук. Сходным образом, период полужизни сокоочищенного фактора Vill сравним с же показателем у других препаратов.

Показана высокая терапевтическая эфтивность концентрата, особенно в слуповторных инъекций при лечении ьных с гемофилией А.

Пример 3. Очистка концентрата бриногена, Первый фильтрат, получаемый при хроографии на колонке иэ фрактогеля

АЭ, как описано в примере 1, содержит риноген, а также альбумин, иммуноглоины и антивирусные средства (твин и

Хроматография проводится в том же буферном растворе, который использовался на предшествующей стадии, после доведения концентрации в нем хлористого натрия до 0,06 М, что предотвращает диализ между двумя хроматографическими стадиями.

Фильтрат, полученный на первой стадии. разводят для получения осмотического давления 280 осМ при рН 6,5. Затем его наносят на вторую колонку и получают новый фильтрат, содержащий альбумин, иммуноглобулины, твин и ТНБФ. Фибриноген адсорбируется на колонке.

После уменьшения О.П. фильтрата до базовой величины колонку элюируют тем же буфером;ионную силу которого предварительно повышают добавлением хлористого натрия до конечной концентрации

0,16 М.

Собранную фракцию фибриногена концентрируют и подвергают диалиэу в кассетной системе. Концентрированный продукт разливают по флаконам и подвергают лиофильной сушке.

Полученный таким образом концентрат фибриногена удовлетворяет требованиям стандарта качества, установленного Европейской Фармакопеей.

Кроме того, он может использоваться в качестве субстрата для приготовления биоклея в соответствии с Европейской заявкой на патент М 884019613.

Пример 4. Получение концентрата фактора фон Виллебранда, Элюат, получаемый при хроматографии на фрактогеле ДЭАЭ в присутствии 0,15 M хлористого натрия, как описано в примере

1, содержит большие количества фактора фон Виллебранда и фибронектина. В нем присутствуют также твин и ТНБФ.

Эту фракцию разводят до получения осмотического давления 386 — 390 мосМ, используя для этой цели хроматографический буферный раствор (лимоннокислый натрий, хлористый кальций, лизин, глицин, рН 7,0, осмотическое давление 18 мосМ).

После этого ее наносят на вторую колонку из фрактогеля ДЭАЭ, уравновешивают тем же буфером, содержащим хлористый

1837880

Составитель Н, Гуляева

Техред M.Mîðãåíòàë - Корректор П. Гереши

Редактор Т. Шубина

Заказ 2879 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 мере 160 ед. Ag/мл {антигенных единиц фактора фон Виллебранда) или 100 RCO мл (e единицах кофактора ристоцетина).

Фракция, содержащая фактор фон Виллебранда, элюируется буфером, к которому добавляют хлористый натрий до конечной концентрации 0,15 M.

Получаемый элюат характеризуется достаточно высокой концентрацией фактора фон Виллебранда, в связи с чем его можно разливать по флаконам и лиофилизировать без дополнительной ультрафильтрации.

Концентрат имеет очень высокую степень очистки при специфической активности более 100 единиц RCO мг. Он содержит некоторое количество фибронектина, однако это не сказывается на его активности.

Пример 5. Получение концентрата фибронектина.

Фактор фон Виллебранда и фибронектин можно разделять благодаря разнице их молекулярных масс. Методом гель - фильтрации на колонке из сефакрила $-400 (R) фирмы Фармация получают первую фракцию, содержащую фактор фон Виллебранда. Следующая фракция содержит фибронекгин, который можно сразу разливать по флаконам и лиофилизировать.

Формула изобретения

Способ разделения белков крови, включающий их хроматографическую очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки и удельной активности фактора Vtt! при одновременном упрощении способа, в качестве источника белков используют криопреципитат плазмы крови, который обрабатывают окисью

5 алюминия, охлаждают до 14 — 16ОС, центрифугируют, супернатант стерилизуют фильтрованием, затем обрабатывают детергентом для инактивации вирусов и наносят на .колонку со смолой, содержащей ДЭАЭ10 группировки, фиксированные на винилполимерном геле, затем загружают колонку с раствором протеинов буферным раствором, содержащим 0,11 M хлористого натрия, при этом фибриноген переводят в фильтрат, а

15 другие протеины абсорбируют на колонке, затем проводят элюцию фибронектина и фактора фон Виллебранда путем увеличения концентрации хлорида натрия в буфере до 0 15 М, затем элюцию фактора Vttt, уве20 личивая концентрацию хлорида натрия до

0,25 М, фибриноген дополнительно очищают хроматографией на гепарин-сефарозе, используя для элюции буферный раствор, содержащий 0,06 M хлористого натрия, 25 фактор фон Виллебранда очищают хроматографией на винилполимерном геле, содержащем фиксированные ДЭАЭ-группировки, используя для элюции буфер, содержащий 0,15 М хлористого натрия, а

30 фибронектин очищают дополнительной гельфильтрацией, при этом все используемые буферные растворы содержат 3 г/л лизина и 9 г/л глицина.