Способ культивирования бактерий

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК

<Я)5 С 12 N 9/78, С 12 P 13/02

I ОСУДАРСТВЕ ННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕ НТУ

f J

I

Ф

6 м к (21) 4742197/13 (22) 05.10.89 (46) 30.08.93. Бюл, N 32 (31) 252645/1988, 046818/1989 с (32) 06,10.88, 28,02.89 (33) JР (71) Хидеаки Ямада, Нитто Кагаку Когио Кабусики Кайся (J P) (72) Хидеаки Ямада и Тору Нагасава (56) EP N 0188316, кл, С 12 N 9/78, опублик. 1986.

EP ¹ 0204553, кл. С 12 N 9/78, опублик.

° 1986.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа культивирования бактерий Rhodococcus rhodochrous, проду. цирующего нитрил — гидратазу, фермента обладающего способностью к гидратации нитрилов до образования соответствующих амидов.

Цель изобретения — повышение активности нитрил-гидратазы.

Сущность изобретения заключается в

ТоМ, что используемый штамм Rhodococcus — rhosochrous I-1 не может продуцировать нитрил-гидратазу в культуральной среде, содержащей ионы железа, а также, что указанный штамм способен продуцировать нитрил-гидратазу в эффективном количестве только в том случае, если культуральная среда содержит ионы кобальта; и кроме того, что присутствие ионов железа в культуральной среде не только сводит к нулю продуцирование нитрил-гидратазы, при условии отсутствия в этой среде ионов кобальта, но и также приводит к снижению

«<итрил-гидратазной активности микроорга„„5U „„1838408 АЗ (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ (57) Использование: биотехнология касаетl ся способа культивирования штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous — продуцента нитрил-гидратазы, Сущность изобретения. в культуральную среду добавляют мочевину или ее производное, используемые в качестве индуктора фермента, а также источник ионов кобальта — хлористый кобальт в концентрации от 5 до 15 мг/л. В качестве продуцента фермента используют штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous I-1

FERM ВР-1478..2 з,п.ф-лы, 3 табл. низма, если в укаэанной среде кроме-ионов кобальта еще присутствуют ионы железа.

Кроме этого, способ культивирования бактерий вида Rhodococcus rhodochrous, сбладающих высокой нитрил-гидратаэной активностью, в соответсгвии с настоящим изобретением, включает в себя добавление в культуральную среду, по крайней мере, одного из соединений: мочевины в производных мочевины, имеющих следующие формулы (!)-(I! !)

Н1В2Й СОЙВЗН4 (!) где R1, R2, Яз и В4 каждый являются -Н, -СНз или -С2Н5, все заместители не являются -Н;

ВИ6ИСООС2Н5 (II) где R5 и В5 каждый являются -Н, -СНз или

-С2Н5: и

NI-I>CSNI-I> (I !) и и она кобальта в целя х получения клеток бактерий, обладающих нитрил-гидратазной активностью, путем культивирования бактерий Rhodococcus rhodochrous, обладающий способностью продуцировать нитрил-гидратазу.

1838408 способностью продуцировать нитрил-гидратазу.

Давление, по крайней мере, одного из соединений: мочевины и производных мочевины формул (I}-(III); и иона кобальта и культуральную среду во время культивирования бактерии Rliodococcus rhodochrous значительно повйшает нитрил-гидратазную активность указанной бактерии на единицу культуральной жидкости.

Э1о повышение нитрил-гидратаэной активности на единицу культуральной среды, вероятно, ведет к увеличению концентрации клеток (т.е., выходу) и/или клеточной активности (т,е., количеству нитрил-гидратазы в клетках);

При осуществлении настоящего изобретения добавление мочевины или ее производного особенно эффективно для повышения клето гной активнос1 и.

Подробное описание изобретения

1. Бактерии Й11одососcus rhodochrous

В настоящем изобретении используются бактерии Юодососсцз hodochrous. обладающие нитрил-гидратаэной активностью и способностью к п1дратации нитрилов, в частности, ароматических нитрилов, до получения соответствующих амидов. Конкретным гримером таких бактерий является штамм 1-1 (FEPM UP-1478)Rhodococcus rhodochrous, описанный в заявке на японский патент ¹ 231744/1988 и в заявке на патент США N 243988, упоминавшихся выше, Ниже приводятся подробное описание указанного штамма I-1, взятые из цитируемых заявок на патент.

1, Происхождение и депонирование

Штамм И был выделен заявителями иэ почвы в Сакис-кю, Киото, Япония, и депонирован 18 сентября 1987 r. Институтом Ферментных исследований, Агенством прикладных наук и технологии, Министерством международной торговли ii промь.шленности Японии, где пн находится на хранении под номером допуска ГЕРМ ВР1478 в соответствии с Будапештским договором.

2. Бактериологические характеристики (а) Морфологические характеристики (2) Форма и размер клетки: 0,9-1,0 мк х

3 — 10 мк (2) Полиморфизм: удлиненные клетки, имеющие форму палочек, в начальной стадии культивации растут до образования прямых палочек с изломом. а затем делятся, образуя короткую бэциллярную форму {3) Подвижность; Неподвижны (4) Образование спор, не образуют (5) Окрашивание: положительно (б) Кислотоустойчивость: отрицательно

35 но культуральнэя средэ christeusou. положи гельно

40 (9) Использование неор)аничсских исто л:,иков азота: нитрат: положительно соль аммония: положительно (10) Образование пигментов: отрица45 тельно (11) Уреаэа: положителыlo (I2) Оксидаза; отрицательно (13) Каталаза: положительно (14) Гидролиэ целлюлозы: отрицательно

- >0 (15) Условия роста: рН: 5 — 10 температура: 10-41 С (16) Реакция на кислород; азробная (17) Разложение тироэина: положительно (18) Разложение аденина, положительно

55 (19) Фосфотаза; положительно (20) Гидролиэ Твина 80: положительно (21) О-F-тест: О (слабый) (22) Термостойкость (в 10% сепарированном молоке при 72 С в течение 15 мин) отсутствует (7) Гетерофильный гранулоцит: наблюдается (I>) Культургльные характеристики различных культуральных сред 30 С

5 (1) Бульонная культура на чашках Петри с агаром; круг с диаметром 1 мм (48 часов), неправильный, довольно сухой на поверхности, плоский, непрозрачный, и бледнооранжево-розового цвета. (2) Бульонная культура на скошенном агаре: волокно с гладкой поверхностью и слегка выпуклой, довольно сухое в поперечном сечении и бледно-оранжево-розового цвета, (3) E ynüouuàÿ культура в жидкой среде: обильный рост с образованием мембраны.

Культуральнэя жидкосл ь становится довольно мутной и образуе-ся прецнпитат в результате роста клеток

20 (4) Бульон ная культура на . столбиках жолатины: хороший рост на поверхности в виде воронки вдоль поверхности столбика, но на нижней поверхности рост ограничен.

Желатин не раэжижен. (5) Лакмусовое молоко: beç изменений. (с) Физиологические свойства: (1) Сни>кение нитрата; поле>кительно (2) Денитрификация: отрицательно (3) MR - тест: отрицательно (4) VP — тест: отрицательно (5) Образование индола: поло>кительно (6) Образование сероводорода. положи. -ел ы о (7) Гидролиэ крэхMànà: отриi)ательно (8) испольэова ив лимо íoil кислоты: культуральная среда Косич: отрицатель1838408 (23) Образование кислоты харида:

Кислота и газа из саГаз

L-Арабиноза

D-Ксилоэа

0-Глюкоза +

D-Манноза

D-cDруктоза +

Мальтоза +

Сахароза

Лактоза

Трегалоза

0-Сорбит

D-Маннит +

Глицерин + (24) Рост в одном источнике углерода:

ИнозИт

Мал ьтоза

Ф

D-Маннит +

Рал111Оэа

0-Сорбит

m-оксобензойная кислота +

Ад.:1пат натрия

Бензоат натрия

Цитрат натрия

Лактат натрия +

Тестотетрон +

* -Тирозин +

Глицерин (1%) (вес/об,) (+)

Трегалоза (+) р-оксибензойная кислота (1%) (вес/об.) + (+): слегка положительно (25) Анализ жирных кислот и клеточной стенки: клетка содержит ненасыщенные и насыщенные с прямой цепью, ТСХ миколовой кислоты дает хроматограмму с единичным Г1ятном.

Согласно оценке вышеперечисленных бактериологических свойств в соответствии с Руководством по систематической бактериологии Берги (1986), штамм I-1 является аэробной, Грамположительной, обладающей слабой устойчивостью к кислотам, каталазо-положительной и не образующей эндоспор палочкой без жгутиков. Этот штамм имеет форму продолговатой палочки и мицелий в начальной стадии роста, растет с ветвлением, а затем делится с образованием коротких палочек. В соответствии с указанными признаками, штамм 1-1 подпадает под тип бактерии Nocardia.

Анализ на состав жирных кислот обнаружил, что бактерия содержит ненасыщенные и насыщенные жирные кислоты с прямой цепью, включа1ощих туберкулостеэриновую кислоту. Поскольку ТСХ миколовой кислоты дает единичное пятно, имеющее такое >ке значение Pf как и стандартная бак10

15. ментов. Может показаться совершенно не30

45

55

25 терия Rhodococcus rhodochrous (IFO 3338), эта бактерия не является бактерией рода

Мусо bacterium. Эта бактерия также отличается от бактерии Nocordia по составу(числу атомов углерода) миколовой кислоты, В результате исследования других биохимических свойств указанная бактерия была идентифицирована как Rhodococcus

rhodochrous.

II. Мочевина и ее производные

В соответствии с настоящим изобретением, мочевина и производные мочевины, имеющие формулы (I) — (I I(), как было указано выше, выполняют функции индукторов ферожиданным, если учесть тот факт, что до настоящего времени типичными индукторами ферментов считались нитрилы или амиды, например, кротонамид, что мочевина и ее производные могут эффективно индуцировать нитрил-гидратазу. При этом было обнаружено, что мочевина и ее производные если и использовать не в комбинации с другими индукторал1и ферл1ентов, а отдельно, показывают значительно более высокую эффективность, чем стандартные индукторы ферментов. Кроме того, мочевина является менее дорогостоящим продуктом по сравнени1о с другими индукторами, но с экономической точки зрения способ настоящего изобретения может быть с успехом применен в промышленности.

Примерами соединений формулы (I), используемых в настоящем изобретении могут служить метилмочевина, этилMo÷åâèна, 1,1-диметилмочевина и 1,3-диметилмочевина.

Примерами соединений формулы (II) являются уретан и метилуретан

Примером соединения формулы (III) является тиомочевина, Мочевина или ее производные добавляются в культуральную среду в один прием, разом, или последовательно. Термин "последовательно" в данном случае означает

"непрерывно" и "с возрастанием". (III) Ион кобальта

Нитрил-гидратаза не может быть получена просто добавлением мочевины или ее производных в культуральную среду, и добавление в культуральную среду иона кобальта является вах(ным фактором настоящего изобретения. (Присутствие иона кобальта является важным для полу:ения нитрил-гидратазы при помощи бактерий, как было предложено в упоминавшихся ранее патентных заявках N. 23.1744/1086, Япония и N 238986, СЩА).

Обычно, ион кобальта образуется при добавлении водорастворимого соединения

1838408 кобальта в водную культуральную среду, Водорастворимые соединения кобальта описаны в хИмических энциклопедиях, и поэтому специалист может легко выбрать для использования одно из наиболее подходящих соединений.

Типичными примерами кобальтовых соединений явллютсл соединения. которые

++ +W ++ дают Со или Со, особенно, Со, такие как хлорид кобальта, сульфат кобальта, ацетат кобальта, бромид кобальта и бора кобальта, Кроме того, и качестве источника кобальта могут быть использованы витамин

В12 и металлический кобальт. Витамин В12 содержит кобальт в виде комплекса, который может быть ионизован при помощи об; работки в автоклаве, а металлический кобальт может быть ионизован посредством ионизирующей функции микроорганизмов во время культивации, (IV), Культивирование/получение нитрид-гидратазы

Бактерия Rhodococcus lhodochrous в соответствии с настолщим .Изобретением может культивироваться при любых условиях, соответствующих целям настоящего изобретения, за искл очением того, что в культуральну о среду добавляются мочевина или ее производные и ион кобальта, Например, заранее определенные количества мочевины или ее производного и ионы кобальта добавляют в основную питательную среду (описание основных сред см.ниже) и культивируют при температуре около 15 — 50 С, предпочтительно, около 2045 С, а более предпочтительно, около 30 С, при рН от 7 до 9, в течение 30 часов или более, предпочтительно, в течение 40 часов или более (до, например, 120 часов). !

Общая концентрация мочевины или ее производных в культурэльной среде составляет около 1-30 г/л, предпочтительно, около 2 — 20 г/л, а более предпочтительно, около

5-15 г/л, тогда как концентрация ионов кобальта составллет около 5 — 15 мг/л (расчет проводился исхОдя из СОС 2), Основная питательная среда:

Культуральная среда А

Компонент Количество (s 1 л среды)

К2Н Р04 13,4 г

КН2РО4 6,5 r

NaCI 1,0г

MgS04 7Н20 0,2 г

Витаминная смесь* 0,1 мл

Дистиллированная остальное кол-во смесь (рн 7,0)

*Состав (в 1л раствора):

Биотин 2,0 мкг

Пантотенат кальция

Инозит

Никотиновая кислота

Гидрохлорид тиаминэ

5 ПиридоксингидрохлориД р-Аминобенэойная кислота 0,2 мг

Рибофлавин 0,2 мг

10 Фолиевая кислота 0,01 мг

Дистиллированнал вода остальное кол-во

Культуральная среда В

К2Н РОа 0,5 r

15 КН2Р04 0,5 г

Mg S04 7Н20 0,5 r

Дрожжевой экстракт 3,0 г

Дистиллированная остальное кол-во вода (рн 7,2)

20 Культурэльная среда С

Глюкоза 10 г

К2НРОа . 05 r

КН2РОа 0,5 г

Mg S04 7Í20 ..0,5 r

25 Дрожжевой экстракт 1,0 г

Пептон 7,5 г

Дистиллированнал - остальное вода кол-во (рН 7,2)

V. Экспериментальные примеры

30 Изменение и определение феоментной активности

0,4 мг (1) Метод измерения нитрил-гидратазной активности

Нитрил-гидратаэную акт .явность определяли следующим образом.

2 мл реакционного раствора, содержащего 1,0 мл бенэонитрила (20 мм), 1,0 мл

3-цианопиридина (1 M) или 1,0 мл акрилнит40 рила (1 М) в качестве субстрата; 0,5 мл калий-фосфатного буфера (0,1 М, рН 7.0), и заранее определенное количество бактериальных клеток (выделенных иэ культуральной жидкости), подвергали реагированию

45 при 20 С в течение заранее определенного периода времени, а затем завершали реакцию добавлением 0,2 мл 1 í HCI, (2) Определение нитрил-гидратазной активности

Ниже приводится ак1ивность, определенная в случае специфической активности

С,A. и в случае общей активности О.А.;

С.А. мкМ амид/мг-клетки/мин

0.À. мкМ амид/мл-культуральная сре55 да/мин

Пример 1. Заранее определенное количество мочевины добавляли в описанную выше основную среду С, содержащую

10 мг/л CoCI2. К каждым 60 мл полученной культуральной среды добавляли 4 мм пре1838408

Таблица1

Мочев на (г/л

7,5

2,0

5,0

10 культуральной жидкости, содержащей

Rhodocaccus rhodochrous, штамм I-1 (FEPM

ВР-1478) полученной с использованием основной среды С, и культивировали. при этом встряхивая, при 28ОС в течение 96 часов.

В целях сравнения, аналогичное культивирование проводили в среде, содержа,щей либо мочевину, либо CoCI2 в

ОТДОЛЪНОСТИ, Полученные результаты систематизированы в таблице 1.

Результаты, приведенные в таблице 1, показывают, что добавлсч1ие мочевины в сочетании с CoCI2 явпяетсл крайне .ва:кным

ДЛЯ 1<ВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУЦ(лРОВаНИЛ НИтРИПгидрэтазы.

П р и и е р 2, Шта.лм 1-1 подвергали

1< !I ьтивированию в соответствии с Оп)1санием а Пр<гмере 1, при 28 С. и тече-пие л8 — 1?0 часов в оснпвнсй сред . С, в присутст ии 10 мг/и СОО2, добавляя ип л не добавлял зара«Ее Опр»депе« 1ое копи гество I"ндукторов ферме«тов (мочеви«у л коотонэ<л)лд}. 1:зк показэ11О в та п11(с )

Значения C А. и С1.А., припаленные в таблице 2, были полу )ены при максимальных значениях С.А. во время измерений активности, )<ак винно,з табпицьь и.",поль Ование в качестве индуктора фермента лишь Одной мочев)лны без крого1 В«гида прив дит I; значительному увели 1»ни)О г (-ä1öèðàâýt)ttë нитрил-гидрэтазьь

Пример 3. Заранее Опредеп:ii«o<= количество производных мочевинь. доб:-пляпи в основ«J!0 сред} С, содер)кэщую 10 мг/п CoC!2. V. ках<дым Я t:n пол(i-:«ной кул ьтурап ь НОЙ среды,<1оба в пяди 4 r ;. п рек у л ь т ) 0 я л ь н О Й х< и;! < О с т и, с О д е р )1; а I ц е Й

1<1)обососсип rhednchrnt)s, лта)л)л 1-1 (ГГРЧ

ВР-1478} попуче)1«ой с использованием ОсНОвной среды С, It куль п.виропал)л. О1-.тряхивая, при 28 (; п течени"-. <15 чзсов.

В целях сравнения, аналоги ное культивирование проводили в среде, содеру<ащей либо метилмочевину, пиба C0CI по Отдель«ости.

Результаты приведены в таблице 3, в которой значения С.А. и О.А. были полу ie»t,i при максимальных значениях С.А, во время измерения активности, В этой таблице добавлены для контроля результаты, полученные для 7,5 гlл мочевины, Результаты, приведенные в таблице, показыва)от, что добавление производного мочевины и CoCf2 ведет Y. значительному повышению продуцирования нитрил-гидратазы.

Формула изобретения

1p 1. Способ культивировайия бактерийштамма Rhodococcus rhodochroits, продуцирующего нитрип-гидрвтазу на питательной среде в присутствии индухтора фермента при оптимзл< них условиях биосинтеза, о т15 л и ч а ю ш 11 lt с я тем, что, с целью повыше" ния активности нитрил-гидратазь, в качестве штамма испопьз.ют Rhodococc

rho(lachrous И Ейск PP l6 1478, з исходну)О питательную среду догголнитепь«о вно20 сят исто I.!".1111; ионов ".Обэп ь)а и

ИСПОЛЬЗУЕ1лЬЕ В Ка »Ство ИНДУКТОРа фЕРмен га мочевину или прпизво )нее моче ины формулы (l) (llj и (lll}

R1Р2МСО1 .)РЯд (!} где Rt, R2, R3 и R< кз>кдь)11 являптс)1 -ill"СН3 или Ссн за ив):I)G iottitoì того, та зсе звMecTIIT ëè не лпппют;я -Н, %ЛЛСООС21 Б (}l} где Rs и Рс ка)кды)л .> Вляетс.)-Н; СР31 ли С.- 1-, ;,, 30 ЫH2CSf Н2

1 11}

CrIocoh пп п.1, О т л и ч 3 го 1ц I! и с я тем, гго кп))цпнтрац(11о моч".sâti или ее производных в питательной ср д» устанвв35 ли(кают от 1,до 30 г/и.

3. Спо :пбпп П,1,отп л - . э гоп,ийся тем, ITo источ«и <Ом ионов ксб ль) в является хп ристый .<Пбапьт в 1<о«не«трации от 5 до l5 мг/п.

Приоритет по призпакэм;

06.10.88 — признаки 1)у)11<тов 1, 2, 3. раскрывающие использ )BRHt)å культд 1)льной среды, содарх<ащей Од))овре(лен))о каны кобальта и мОчев1лну.

28,0?.89- г.ризнзки пунктов 1, 2, 3, ргс)

Продолжение табл.1

Таблица 2

Таблица 3

: Составитель И. Привалова

Техред М. Морген ал Корректор .Т, Вашкович

Редактор

Заказ 2905 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 с

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101